Title:
Vorrichtung und Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
Kind Code:
A1


Abstract:

Offenbart wird eine Vorrichtung zur Aufreinigung von Nukleinsäuren durch negative Chromatographie, umfassend einen Hohlkörper mit jeweils einer Öffnung am oberen und am unteren Ende, welcher eine stationäre feste Phase enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase mindestens zwei verschiedene Chromatographie-Harze wie z. B. Größenausschluss-Gelfiltrationsmaterialien (SEC-Materialien) beinhaltet, sowie ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren und die Verwendung der Vorrichtung.




Inventors:
Müller, Markus, Dr. (Dormagen, 41542, DE)
Application Number:
DE102007005655
Publication Date:
08/07/2008
Filing Date:
01/31/2007
Assignee:
QIAGEN GmbH (Hilden, 40724, DE)
Domestic Patent References:
DE10201487A1N/A2002-07-25



Foreign References:
200400020812004-01-01
EP01719161986-02-19
WO2001094574A22001-12-13
EP15893372005-10-26
WO2004011142A12004-02-05
Attorney, Agent or Firm:
Gille Hrabal Struck Neidlein Prop Roos (Düsseldorf, 40593)
Claims:
1. Vorrichtung zur Aufreinigung von Nukleinsäuren durch negative Chromatographie, umfassend einen Hohlkörper mit jeweils einer Öffnung am oberen und am unteren Ende, welcher eine stationäre feste Phase enthält, dadurch gekennzeichnet, dass die stationäre Phase mindestens 2 verschiedene Chromatographie-Harze wie z. B. Größenauschluss-Gelfiltrationsmaterialien (SEC-Materialien) beinhaltet.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, darüber hinaus umfassend eine oder mehr Ultrafiltrations- und/oder Mikrofiltrationsmembranen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, darüber hinaus umfassend ein oder mehr Chromatographie-Harze zusätzlicher Selektivitäten wie z. B. hydrophobe Interaktionschromatographie-Harze, Affinitätschromatographie-Harze, Ionenaustauschchromatographie-Harze

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, wobei die SEC-Materialien in weitgehend homogenem Gemisch vorliegen.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die SEC-Materialien in Schichten angeordnet sind.

6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, darüber hinaus umfassend eine oder mehrere Fritten.

7. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, darüber hinaus umfassend Anschlussvorrichtungen zum Anlegen von Vakuum oder Überdruck, zur Zentrifugation, und/oder zur Detektion.

8. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche in Form einer Mikrotiterplatte oder eines Eppendorffröhrchens.

9. Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche durchgeführt wird.

10. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.

11. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Nukleinsäuren ausgewählt werden aus genomischer DNA, Plasmid-DNA, RNA, PCR-Fragmenten oder Oligos.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren sowie die Verwendung der Vorrichtung.

Verschiedene Nukleinsäuren werden in einer Reihe von Gebieten eingesetzt, so z. B. der rekombinanten Gentechnik, in der medizinischen Diagnostik, als Sonden und vieles mehr. Dabei besteht häufig die Notwendigkeit, Nukleinsäuregemische verschiedensten Ursprungs von kontaminierenden, nachfolgende Reaktionen störenden, Substanzen aufzutrennen. Dafür sind verschiedene Verfahren bekannt.

Generell werden die Nukleinsäuren häufig durch chromatographische Verfahren gereinigt und/oder aufkonzentriert, bei denen sie an Oberflächen aus z. B. Siliziumdioxid, Siliziumdioxidpolymeren, Magnesiumsilikat oder ähnlichem adsorbiert werden, gefolgt von Waschen und Desorption jeweils mit geeigneten Lösungsmitteln. Hierbei werden durch das Waschen die unerwünschten Verunreinigungen entfernt, und durch die Desorption schließlich die gewünschten Nukleinsäuren eluiert.

Diese im Laborjargon als „bind-wash-elute" bezeichnete Routine ergibt sich bei allen Aufreinigungsverfahren, bei welchen das aufzureinigende Zielmolekül (z. B. Nukleinsäuren) zuerst in eine Bindung mit einem Trägermaterial (Silika, Ionenaustauscher, hydrophobe-Interaktion Chromatographie-Harze, Reversed-Phase-Chromatographie-Harze, Mixed-Mode-Chromatographie-Harze, Affinitätschromatographie-Harze) gebracht wird. Zwar ergeben sich aus dieser Verfahrensweise in der Regel qualitativ hochwertige Präparationen des Zielmoleküls, andererseits ist jedoch die Anzahl der Arbeitsschritte relativ hoch.

Es wäre wünschenswert, ähnliche Reinheitsstufen mit Aufreinigungsmethoden, die weniger Schritte beinhalten, zu erhalten.

Besonders geeignet ist hierfür die Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography, SEC). Wenn ein organisches Lösungsmittel als mobile Phase verwendet wird, wird dieses Verfahren auch als Gelpermeationschromatogrphie (GPC) bezeichnet, bei Verwendung einer wässrigen mobilen Phase als Gelfiltrationschromatographie. Bei der SEC erfolgt die Trennung rein aufgrund der Größe (genauer gesagt des hydrodynamischen Volumens) der Moleküle in der Probenlösung. Für ähnlich geformte Moleküle ist der hydrodynamische Radius proportional zum Molekulargewicht, daher wird die SEC auch als massenbasiertes Trennverfahren bezeichnet.

Ein GPC-System oder SEC-System umfasst im allgemeinen Pumpe, Injektionssystem, Trennsäule(n) und Detektor(en). Die Pumpe saugt das Laufmittel (mobile Phase), z. B. einen geeigneten Elutionspuffer, an und erzeugt einen Fluss durch das gesamte System. Durch das Injektionssystem (manuell oder automatisch) erfolgt das Aufbringen der Probe auf die Trennsäule, in der die Probe aufgrund des unterschiedlichen hydrodynamischen Radius der Bestandteile aufgetrennt wird. Der Nachweis erfolgt durch Detektoren.

Die Trennsäulen sind mit der stationären Phase gefüllt, d. h. mit kleinen Kügelchen eines porösen hochvernetzten Materials. Es gibt zahlreiche verschiedene chromatographische Materialien für die SEC. Jedes Material ist durch ein „Exklusionslimit" charakterisiert, das die geeignete obere Grenze für die Moleküle bezeichnet, die mit diem Material getrennt werden können. Als Materialien kommen z. B. Polyacrylamid, Dextran oder Agarose oder auch Silika, vernetztes Polystyrol o. ä. zur Anwendung. Verbreitet werden Sephadex®, Sephacryl® oder Sepharose® (Pharmacia), Biogel® (Bio-Rad), oder Fractogel® (Merck) verwendet.

Die Trennung bei der SEC basiert auf der Verteilung der Moleküle zwischen der Flüssigkeit zwischen den Kügelchen aus chromatographischen Material und der Flüssigkeit in den Poren innerhalb dieser Kügelchen. Der Durchmesser der Kügelchen liegt im μm-Bereich. Eluiert man eine Probe, die Moleküle verschiedener Größe enthält, so gelangen die kleinen Moleküle in die Poren der stationären Phase und verweilen daher länger auf der Säule als die größeren Moleküle, die daher zuerst eluiert werden. Im allgemeinen haben die verwendeten Säulen eine sehr geringe Porengrößenverteilung und trennen sehr gut in einem bestimmten Molekülgrößenbereich, Um eine Trennung über einen größeren Molekulargewichtsbereich zu erzielen, müssen mehrere Trennsäulen mit verschiedenen Porengrößen hintereinander geschaltet werden.

Bei der üblichen SEC-Chromatographie von Nukleinsäuren werden folglich die Verunreinigungen mit geringer Molekülgröße auf der Säule zurückgehalten, während die gewünschten Nukleinsäuren gemeinsam mit Verunreinigungen wie anderen unerwünschten Nukleinsäuren eluiert werden, so dass anschließend noch weitere Trennschritte erforderlich sind, um diese Gemische aufzutrennen. Dieses Verfahren, bei dem die gewünschten abzutrennenden Substanzen zuerst eluiert werden, bezeichnet man auch als „negative Chromatographie". Insbesondere bei der Isolierung von RNA, z. B. aus PCR-Reaktionen, ist es aber problematisch, dass mehrere Nukleinsäuren unterschiedlicher Größe gemeinsam eluiert werden, da durch die übliche SEC-Chromatographie die RNA gemeinsam mit großen DNA-Molekülen eluiert wird, während nur kleinere Moleküle auf der Säule verbleiben, und die RNA dann in einem weiteren Schritt von den DNAs abgetrennt werden muss.

Als weiteres Verfahren zur Abtrennung und Aufkonzentrierung hochmolekularer Substanzen ist die Ultrafiltration (für Partikel von < 0,1 μm Durchmesser) bzw. Mikrofiltration (für Partikel von > 0,1 μm) Durchmesser) bekannt. Beide Verfahren sind physikalische Membrantrennverfahren. Alle Inhaltsstoffe in Flüssigkeiten, die größer als die Membranporen sind, werden von der Membran zurückgehalten. Treibende Kraft in beiden Verfahren ist die Druckdifferenz zwischen Zulauf und Ablauf der Filterfläche. Der Werkstoff der Filterfläche kann z. B. Edelstahl, Kunststoff oder textiles Gewebe sein. Die Ausschlussgrenze (Cut-off) wird üblicherweise als NMWC (Nominal Molecular Weight Cut-off) in der Einheit Dalton (Da) angegeben.

Ein DNA-Ultrafiltrationsverfahren ist z. B. in DE-A 102 01 487 offenbart.

US 2004/0002081 offenbart ein Verfahren zur Isolation und Reinigung eines Polynukleotids im industriellen Maßstab, welches von einem chromatographischen Verfahren Gebrauch macht, bei dem mindestens zwei verschiedene chromatographische Schritte durchgeführt werden, ausgewählt aus hydrophober Wechselwirkungs-Chromatographie, polarer Wechselwirkungs-Chromatographie und Anionenaustauschchromatographie, wobei in mindestens einem Schritt der chromatographische Träger ein monolithisches poröses Bett ist.

EP-A 1 719 16 offenbart ein Material zur Abtrennung und Reinigung von DNA, das ein integraler monolithischer poröser Körper aus Glas oder Silika ist, der von einem zum anderen Ende durchgehende Poren aufweist, die Nucleinsäuregrößen von 35 bp bis 100 Kbp entsprechen, so dass die entsprechenden Nukleinsäuren in diesen Poren zurückgehalten werden.

WO 01/94574 offenbart ein Material zur Reinigung von DNA-Sequenzierungsreaktionsprodukten, d. h. zur Abtrennung der DNA-Sequenzierungsfragmente von Sequenzierungs-Templaten, Enzymen, Salzen und Nucleotiden, wobei ein Filtrationsmedium mit einem molekularen Cutoff-Filter in einer einzigen Chromatographie-Säule kombiniert wird. Z. B. wird ein SEC-Material wie Sephadex® G-50 oder Sephacryl® mit einer Whatman-Polyfiltronics®-Ultrafiltrationsmembran kombiniert.

EP-A-1 589 337 offenbart ein Packungsmaterial für die Flüssigkeitschromatographie, welches Partikelmischungen aus mindestens zwei Komponenten umfasst, zur Trennung von kleinen Molekülen, Proteinen oder Nukleinsäuren. Die Partikel können aus beliebigen anorganischen und/oder anorganisch-organischen Hybridmaterielien bestehen, die für die chromatographische Anwendung geeignet sind, z. B. Silikapartikeln. Die beiden Komponenten haben jeweils eine Partikelgrößenverteilung und einen mittleren Partikeldurchmesser, wobei die Differenz zwischen zwei mittleren Partikeldurchmessern geringer ist oder gleich 40% des größeren Mittelwerts ist.

WO 2004/011142 offenbart eine Vorrichtung zur Reinigung einer Probe, z. B. enthaltend Nukleinsäuren, in der ein SEC-Material und ein Ionenaustauschmaterial (IEC-Material) kombiniert sind. Insbesondere werden sogenannte „size-exclusion ion-exchange" (SEIE) Partikel offenbart, wobei beispielsweise ein Kern aus einem Ionenaustauschermaterial, das ggf. zum Größenausschluss fähig ist, von einer Hülle aus einem SEC-Material umgeben ist. Es können auch mehrere derartige SEIE-Materialien in einer einzigen Chromatographiesäule verwendet werden.

Im allgemeinen werden die bekannten Chromatographieverfahren im mg-Maßstabe (bezogen auf die zu trennende Substanz) auf üblichen Trennsäulen durchgeführt, wobei die Abmessungen der Säule und die Menge der stationären Phase an die Menge der zu reinigenden Substanz geeignet angepasst wird. Für die Elution wird das Lösungsmittel unter Druck (durch Pumpen erzeugt) in das obere Ende der Säule eingebracht.

Zur Reinigung kleinerer Mengen von weniger als 10 mg zu reinigender Substanz sind auch wesentlich kleinere Chromatographievorrichtungen bekannt. Z. B. wird die stationäre Phase in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten eingebracht, das zu trennende Gemisch in die Vertiefungen gegeben, Laufmittel in die Vertiefungen eingebracht und dann durch Anlegen von Vakuum eluiert, oder die stationäre Phase wird auf einer Fritte in ein unten offenes Eppendorfröhrchen gegeben, die zu trennende Substanz und das Laufmittel werden aufgebracht, und dann wird das Röhrchen in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und die Elution durch Zentrifugieren bewirkt, so dass das Eluat sich im Zentrifugenröhrchen sammelt und dort entnommen und weiter aufgearbeitet werden kann. Auf diese Weise wird z. B. bei der Aufarbeitung von PCR-Reaktionsgemischen durch Zentrifugieren mit DyeEx® (Qiagen GmbH) chromatographiert, um Farbmarker und Primer von den PCR-Produkten abzutrennen.

Auch Chromatographievorrichtungen in mikrofluidischen Chips sind bekannt.

Bei all diesen Verfahren im kleinen Maßstabe ist im Stand der Technik aber jeweils nur die Verwendung eines einzigen SEC-Materials pro Chromatographieschritt bekannt, so dass ggf. mehrere Chromatographieschritte nacheinander durchgeführt werden müssen.

Ein Problem bei den bekannten Vorrichtungen und Verfahren zum Reinigen von DNA besteht daher darin, dass zum Kombinieren mehrerer Selektivitäten immer mehrere Säulen hintereinandergeschaltet werden müssen. Die Auslegung der Säulen auf bestimmte gewünschte Selektivitäten war daher immer sehr zeit- und materialaufwendig.

Es war also eine Chromatographievorrichtung für Nukleinsäuren, bzw. die Kombination von Chromatographie und Membranverfahren gewünscht, mit der die Selektivität bzw. die Retentionszeit und die Ausschlusseigenschaften (Cut-off) leicht eingestellt werden können. Zudem war ein Einschritt-Verfahren erwünscht, bei dem die gewünschten Nukleinsäuren einer bestimmten Größe in einem einzigen Schritt sowohl von kleineren Verunreinigungen als auch von größeren Nukleinsäuren abgetrennt werden können.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung einer solchen Vorrichtung.

Die Aufgabe wird gelöst durch die Vorrichtung zur negativen Chromatographie nach Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Ansprüchen 2 bis 6 definiert. Weiter werden ein Verfahren zur Aufreinigung von DNA unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie die Verwendung der Vorrichtung beansprucht.

Erfindungsgemäß werden erstmals SEC-Medien verschiedener Selektivitäten kombiniert und als Gemisch oder schichtweise in einer einzigen Vorrichtung eingesetzt. Bisher war es immer notwendig, mehrere Chromatographievorrichtungen, die jeweils verschiedenen SEC-Medien enthielten, hintereinander zu schalten. Durch die erfindungsgemäße Vorrichtung ist daher eine beträchtliche Zeitersparnis möglich. Insbesondere durch die als bevorzugte Ausführungsform beanspruchte Kombination mit Mikro- und oder Ultrafiltrationsmembranen ist eine beliebig einstellbare Selektivität möglich. Bisher wurden derartige Membranen nicht mit SEC-Materialien kombiniert, um so die Selektivität weiter einzustellen.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können verschiedenste Nukleinsäuren gereinigt und/oder aufkonzentriert werden, z. B. genomische DNA, Plasmid-DNA, verschiedenste RNAs, PCR-Fragmente, Oligos oder Restriktionsfragmente. Besonders geeignet ist die Vorrichtung zur Abtrennung von RNAs aus Gemischen, die größere DNAs enthalten. Allgemein kann aber dieses Trennprinzip zu einer Separation der Proteinfraktion von der RNA-Fraktion und gDNA-Fraktion aus einer Probe führen und für weitere Analysen zur Verfügung stehen, so dass eine parallel nachgeschaltete Analyse des Genoms, Transkriptoms und Proteoms möglich ist. Das beschriebene Trennprinzip kann weiterhin auch für andere Applikationen wie Plasmidaufreinigung etc eingesetzt werden, Die Proben liegen i. a. in Form einer Lösung vor, wobei als Lösungsmittel üblicherweise salzhaltige, geklärte Zelllysate verwendet werden. Die Lösung kann eine direkt aus einer Reaktion erhaltene Produktlösung oder eine nach einer beliebigen Aufarbeitung erhaltene Probenlösung sein. Die Probe kann vor dem Aufgeben auf die erfindungsgemäße Vorrichtung z. B. durch Filtration oder Zentrifugation, vorbereitet werden (z. B. Klärung von alkalischen Bakterienlysaten.

Als SEC-Materialien können alle bekannten SEC-Materialien eingesetzt werden, z. B. Superdex®, Sephacryl® oder Superose® (Pharmacia), Biogel® und Biosil® (Bio-Rad), und Fractogel EMD BioSEC® (Merck). Es sind SEC-Materialien mit Ausschlussbereichen (Cut-off) von 100 bis 500.000 Da oder mehr verfügbar. Die Materialien werden in geeigneter Weiser so kombiniert, dass die gewünschte Größenselektion maßgeschneidert auf das Zielmolekül in gewünschter Weise in einem Schritt erzielt wird, Durch geeignete Wahl der SEC-Kombination können unerwünschte Verunreinigungen wie Salze, Metabolite, Proteine, unerwünschte Nukleinsäuren, Fette etc. auf der Säule zurückgehalten werden, während die erwünschten Nukleinsäuren, aber auch Proteinfraktionen, eluiert werden und somit isoliert werden können.

Es ist des weiteren vorstellbar innerhalb einer solchen „Verbund"-Säule weitere Selektivitäten wie z. B. Anionenaustauscher und HIC-Funktionalitäten bzw. -resins hinzuzufügen. So wäre z. B. die Kombination eines Anionenaustauscher-Harzes, geschichtet oberhalb eines Entsalzungs-Gelfiltrationsmateriales innerhalb eines Zentrifugations- oder Vakuumröhrchens geeignet zur stufenweisen Elution von entsalzten Protein-, RNA- und gDNA-Fraktionen.

Die äußere Form der Vorrichtung ist nicht besonders beschränkt. Es kann jede übliche für die Chromatographie verwendete Form eingesetzt werden.

Normalerweise werden runde Säulen aus Glas oder Kunststoff eingesetzt, die am oberen und unteren Ende Öffnungen aufweisen, und deren Durchmesser im Verhältnis zur Länge klein ist. Bevorzugt enthält die Vorrichtung am unteren Ende eine Fritte aus Glas oder einem anderen geeigneten Material. Sie weist weiter bevorzugt Vorrichtungen zum Anlegen von Vakuum oder zum Erzeugen von Überdruck auf, auch diese sind allgemein bekannt.

Die Größe der Vorrichtung ist ebenfalls nicht beschränkt. Sie kann für Trennungen vom Nanogrammbereich bis zu Mengen von mehreren Gramm bis Kilogramm ausgelegt werden. Es kann daher mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Labormaßstab (ng bis μg-Maßstab) bis zum präparativen Maßstab (g- bis kg-Maßstab) gearbeitet werden.

Erfindungsgemäß kann die Vorrichtung insbesondere auch in Form einer Mikrotiterplatte vorliegen, in deren Vertiefungen die SEC-Materialien entweder weitgehend homogen gemischt oder schichtweise eingebracht werden, oder auch in Form von unten offenen Röhrchen, z. B. Eppendorf-Röhrchen, in die die SEC-Medien weitgehend homogen gemischt oder schichtweise eingebracht werden. Zweckmäßig weisen die Röhrchen in diesem Fall am unteren Ende eine Fritte auf, damit das SEC-Medium im Röhrchen gehalten wird. Die Vorrichtung kann auch als Kavität in einem mikrofluidischen Chip vorliegen.

Die SEC-Materialien können erfindungsgemäß entweder vor dem Befüllen der Vorrichtung gemischt und dann als weitgehend homogenes Gemisch in die Vorrichtung eingefüllt werden, oder sie werden geschichtet eingefüllt, wobei die Schichtdicken geeignet ausgewählt werden, je nach Kapazität des gewählten Materials für die zu entfernende Kontaminante im stöchiometrischen Verhältnis zum Vorhandensein einer solchen Kontaminante in der Probe. Die Schichtdicken der einzelnen Schichten können annähernd gleich oder auch unterschiedlich sein. Durch die Befüllung in Schichten wird überraschenderweise erreicht, dass die Trennleistung sich, verglichen mit dem korrespondierenden mixed-bed-Modus, erhöht.

Die Vorrichtung ist hinsichtlich der Anschlüsse so aufgebaut, dass sie im Zentrifugations-, Vakuum-, Druck- oder Schwerkraft-Modus betrieben werden. Es handelt sich hierbei um den üblichen im Stand der Technik bekannten Aufbau einer Chromatographievorrichtung. Besonders bevorzugt ist es, die Vorrichtung für Trennungen im kleinen Maßstabe einzusetzen (bis zu 10 mg zu trennende Substanz) und dann die Elution durch Vakuum, Druck oder Zentrifugieren zu bewirken.

Besonders bevorzugt weist die erfindungsgemäße Vorrichtung darüber hinaus eine oder mehrere Mikro- und/oder Ultrafiltrationsmembranen auf, die unterhalb und/oder oberhalb der SEC-Medien angeordnet werden. Die Mebranen können auch innerhalb der SEC-Materialien angeordnet sein, d. h. entweder das Gemisch oder einzelne Schichten können sowohl oberhalb als auch unterhalb der Membran angeordnet sein. Diese Membranen werden aus den üblichen am Markt erhältlichen in geeigneter Weise ausgewählt, z. B. Mikrofiltrationsmembranen der Cut-off-Bereiche zwischen 0,2 μm bis 10 μm, für Grobklärungen z. B. Miracloth® (Calbiochem) und Ultrafiltrationsmembranen zwischen 50 und 1000 kDa.

Die SEC-Materialien und Mikro- bzw. Ultrafiltrationsmembranen werden erfindungsgemäß entsprechend der Größe der zu isolierenden Nukleinsäuren geeignet ausgewählt. Große Nukleinsäuren können entweder durch reverse Reinigung mit SEC-Medien mit großen Ausschlussgrößen gereinigt werden, oder sie können durch Mikro- oder Ultrafiltration mit Membranen mit geeignetem Cut-off zurückgehalten werden. Kleinere Nukleinsäuren können durch Kombination verschiedener SEC-Materialien mit geeigneten Cut-offs auf der Säule zurückgehalten werden. Das Mischen verschiedener SEC-Materialien mit unterschiedlichen Größenselektivitäten ermöglicht so das Zurückhalten unerwünschter Verunreinigungen, während die gewünschten Nukleinsäuren eluiert werden. Die Kombination mehrerer SEC-Medien mit Mikro- und/oder Ultrafiltrationsmembranen kann die Größenselektivität in einem einzigen Reinigungsschritt weiter erhöhen. Das Gleiche gilt für die Addition von weiteren Trennprinzipien innerhalb desselben Säulenkörpers. So ist es erfindungsgemäß erstmals möglich, z. B. RNAs in einem einzigen Reinigungsschritt einerseits von kleinen Verunreinigungen wie Templaten, Primern, Fetten, Salzen, Metaboliten, Proteinen abzutrennen, die durch die geeignet ausgewählten SEC-Materialien auf der Säule zurückgehalten werden, und gleichzeitig die unerwünschten größeren Nukleinsäuren wie genomische DNA ebenfalls in demselben Schritt abzutrennen, da diese durch die UF/MF-Membran zurückgehalten und abgetrennt werden. In einer Variante dieser Anwendung wird die genomische DNA vor Auftrag auf eine solche Verbundsäule erst über selektiv präzipitierende Agentien ausgefällt, was dann eine Abtrennung über grobporigere Filtermaterialien aus dem Mikro- und Tiefenfiltrationsbereich möglich macht.

Als Elutionsmedium werden geeignete übliche Elutions- bzw. Laufpuffer oder Lösungsmittel eingesetzt wie z. B. Wasser, oder leicht gepufferte Lösungen wie Tris-, Mops- und Citratpuffer.

Das Eluat wird in Fraktionen beliebiger Größe aufgefangen.

Die Detektion erfolgt durch übliche Detektoren, z. B. mit ultraviolettem Licht (UV-Detektor) oder mit funktionellen Assays wie PCR-Reaktionen.

Die die gewünschten Nukleinsäuren enthaltenden Fraktionen werden entweder direkt in nachgeschalteten Reaktionen weiter analysiert oder durch Methoden des Stands der Technik für weitere Analysen aufkonzentriert (Fällung/Resuspension, Ultrafiltration, Bindung an eine weitere Säule und konzentrierte Elution).

Beispiele

Ein 2,0 ml Plastik-Reaktionsgefäß mit Auslass am unteren Ende wird zuerst mit 500 μl Sephadex G50 und anschließend mit 500 μl Sephacryl S-500 befüllt. Beide Materialien werden durch die vor der Öffnung liegende Fritte aus geeignetem, handelsüblichem Material in dem Reaktionsgefäß zurückgehalten. Nach Auftrag von 1 ml geklärtem, Plasmid-haltigem Bakterienlysat wird das Gefäß zentrifugiert. Im Durchlauf befindet sich aufgereinigte und entsalzte Plasmid-DNA.

Durch Auflegung einer Ultrafiltrationsmembran z. B. mit einem „Cut-off" von 500 kDa oberhalb der Fritte oder oberhalb des Resin-Bettes können kontaminierende gDNA-Anteile auf der Säule zurückgehalten und an einer Co-Elutlon mit der Plasmid-DNA gehindert werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Patentliteratur

  • - DE 10201487 A [0012]
  • - US 2004/0002081 [0013]
  • - EP 171916 A [0014]
  • - WO 01/94574 [0015]
  • - EP 1589337 A [0016]
  • - WO 2004/011142 [0017]