Title:
Verfahren zur Identifikation von Urotensin-2Konvertase-Inhibitoren
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von Inhibitoren von Urotensin-2-konvertierenden Enzymaktivitäten. Erfindungsgemäß wird eine Proteinfraktion durch mindestens einen Chromatographieschritt in Fraktionen aufgetrennt, die Urotensin-2-konvertierenden Enzymaktivitäten der getrennten Fraktionen bestimmt, und eine Fraktion mit Urotensin-2-konvertierender Aktivität wird in einem Verfahren zur Identifikation von Modulatoren von Urotensin-2-konvertierenden Enzymaktivitäten eingesetzt. Bei einem solchen Verfahren wird eine chemische Verbindung einer Proteinzubereitung mit Urotensin-2-konvertierender Aktivität zugesetzt und die resultierende Urotensin-2-konvertiertende Aktivität wird gemessen. Insbesondere offenbart die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation von Urotensin-2-konvertierenden Enzymaktivitäten, bei dem Komplementfaktor 1 als Urotensin-2-konvertierendes Enzym eingesetzt wird.




Inventors:
Thiemann, Joachim, Dr. (Berlin, 10557, DE)
Schlüter, Hartmut, Prof. Dr. (Berlin, 12163, DE)
Zidek, Walter, Prof. Dr. (Berlin, 14167, DE)
Kurzawski, Sandra (Berlin, 14129, DE)
Application Number:
DE102006049822
Publication Date:
04/24/2008
Filing Date:
10/19/2006
Assignee:
Charité-Universitätsmedizin Berlin (Berlin, 10117, DE)
International Classes:



Foreign References:
WO2004029286A22004-04-08
WO2004028658A12004-04-08
Other References:
UNOsphereTM S Cation exchange support, Bulletin
2669 US/EG Rev A. Bio-Rad, Hercules, CA 94547,
USA, o. J.;
Jankowski, J. [u.a.]: Mass-Spectrometry-Linked
Screening of Protein Fractions for Enzymatic
Activities - A Tool for Functional Genomics, In:
Anal. Biochem., 2001, Vol. 290, S. 324-329;
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2004, Vol. 310, s. 209-214;
Biemann, K.: Sequencing of peptides by tandem mass
spectrometry and high-energy collision induced
dissociation, In: Meth. Enzymol., 1990, Vol. 193,
S. 455-479;
Attorney, Agent or Firm:
Maikowski & Ninnemann, Pat.-Anw. (Berlin, 10707)
Claims:
1. Verfahren zur Identifikation von chemischen Verbindungen, welche die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität modulieren,
dadurch gekennzeichnet, dass
in einem Isolationsschritt eine aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe durch einen oder mehrere chromatographische Schritte in mehrere Fraktionen aufgetrennt wird, die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der einzelnen Fraktionen nach mindestens einem chromatographischen Schritt bestimmt wird, eine Fraktion, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, isoliert wird, und anschließend diese isolierte Fraktion
in einem Aktivitäts-Assay-Schritt mit einer chemischen Verbindung unter physiologischen Bedingungen gemischt und die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Mischung bestimmt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Isolationsschritt eine Anionenaustauschchromatographie, eine hydrophobe Interaktionschromatographie und/oder eine Kationenaustauschchromatographie umfasst.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Anionenaustauschchromatographie und/oder die hydrophobe Interaktionschromatographie mit einer stationären reverspolaren Aminoethylphase und einer mobilen wässrigen Phase mit pH 7, und/oder die Kationenaustauschchromatographie mit einer Sulfationengruppen enthaltenen stationären Phase und einer mobilen wässrigen Phase mit pH 5 eingesetzt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, wobei die aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe Blutplasma umfasst.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe die Cohn-IV-Fraktion aus menschlichem Blutplasma umfasst.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Bestimmung der Urotensin-2-Konvertase-Aktivität durch massenspektrometrischen Vergleich von Fragmentierungsmustern einer Substrat-Produktmischung eines Substrates der Urotensin-2-Konvertase und Urotensin erfolgt.

7. Verfahren zur Bestimmung eines Proteins, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität aufweist, wobei in einem ersten Schritt eine Verbindung, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität besitzt, vermittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis 6 identifiziert wird,
in einem zweiten Schritt mit einer Affinitätschromatographie an einer festen Phase, an die eine im ersten Schritt identifizierte Verbindung gebunden ist, eine gereinigte Proteinprobe, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, in Fraktionen aufgeteilt wird, und nachfolgend die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Fraktionen bestimmt wird,
mindestens eine Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthaltende Fraktion einem unvollständigen proteolytischen Verdau ausgesetzt wird,
die durch unvollständigen proteolytischen Verdau entstandenen Fragmente mittels Massenspektrometrie hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz analysiert und zumindest einer Peptidsequenz zugeordnet werden, und die zumindest eine Peptidsequenz durch Datenbankabgleich zumindest einem in einem Säugetier exprimierten Protein zugeordnet wird.

8. Verfahren zur Identifikation von chemischen Verbindungen, welche die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität eines Proteins regulieren, wobei ein Protein, welches die Aminosäuresequenz SEQID1 oder eine zu mindestens 80% mit SEQID1 homologe Sequenz umfasst, mit einer chemischen Verbindung unter physiologischen Bedingungen gemischt und die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Mischung bestimmt wird.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von Urotensin-2-Konvertase-Inhibitoren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Urotensin-2 (UII, U-2) ist ein kardiovaskulär aktives Neuropeptid, welches in Säugetieren und Fischen gefunden wurde. Das humane Urotensin-2 ist ein zyklisches Undekapetid. Je nach Spezies und Wirkort bzw. -Gewebe kann UII sowohl gefäßverengend als auch gefäßerweiternd wirken. Physiologisch wird UII, wie die meisten als Gewebshormone aktiven Peptidhormone, aus einem größeren Präpropeptid durch proteolytische Spaltung freigesetzt und aktiviert. Die daran beteiligten Enzyme werden gemeinhin als „Konvertasen" bezeichnet. Bei Menschen sind Prepropeptide von 124 und 139 Aminosäuren Länge bekannt, welche beide identisches UII hervorbringen.

Es ist bekannt, dass das Präprohormon Pro-UII Schnittstellen für die Proteasen Furin und Trypsin enthält. Ebenso wurde in Experimenten in-vitro gefunden, dass Inhibitoren dieser Proteasen die Bildung von UII inhibieren (J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul;310(1):209–14); eine Zuordnung dieser Aktivitäten zu konkreten Proteinen erfolgte aber nicht. Nach unserem Wissen ist das oder sind die physiologischen Urotensin-2-konvertierenden Enzyme (UCE) nicht bekannt. Die Begriffe Urotensin-2-Konvertase und Urotensin-2-konvertierendes Enzym werden im Rahmen dieser Erfindung synonym verwendet.

Eine erhöhte Expression von UII sowie dem UII-Rezeptor wurde in Tiermodellen des induzierten Myokardinfarkts und des Herzversagens beobachtet. In der Klinik wurde bei menschlichen Patienten ebenfalls eine Assoziation von erhöhter UII-Expression mit Herzinfarkt, Herzversagen, erhöhtem Blutdruck, Artherosklerose und diabetischer Nephropathie nachgewiesen (Khan et al., Int J Cardiol. 2006 Aug 1; Zhu et al., Br J Pharmacol. 2006 Aug; 148(7):884–901).

Urotensin-2 wird als Mittler zwischen den Mechanismen, welche für die Entstehung von Bluthochdruck einerseits und Koronarerkrankungen andererseits verantwortlich sind, bezeichnet (Watanabe et al., Hypertens Res. 2006 Jun; 29(6):375–87). Angesichts der enormen gesundheitsökonomischen Bedeutung dieser beiden Krankheitskomplexe liegt es auf der Hand, dass eine pharmazeutische Modulation der Aktivität des Urotensin-2 von erheblichem medizinischen Nutzen sein könnte. Ebenfalls in Betracht für eine solche pharmazeutische Intervention kommt das unmittelbar vor UII in der Hierarchiekette stehende Enzym, UCE, welches Urotensin-2 aus dem Vorläuferpeptid aktiviert. Unter anderem könnte ein Inhibitor für Urotensin-2-Konvertase als Kandidat zur Behandlung von Bluthochdruck eingesetzt werden.

Insofern sind Verfahren und Mittel wünschenswert, die es erlauben, Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität von UCE verändern.

Eine wesentliche Voraussetzung dafür ist die molekulare Identifikation des vorstehend als UCE bezeichneten Enzyms, welches im Menschen das Vorläuferpeptid zu aktivem Urotensin-2 umwandelt.

Eine große Zahl von Proteasen ist bekannt. Häufig wirken Proteasen in Kaskaden, das bedeutet, dass eine erste Protease durch ein physiologisches Signal aktiviert wird und sich selbst autokatalytisch spaltet, worauf ein freigesetztes Spaltprodukt ein zweites Glied in der Kaskadenkette durch Proteolyse aktiviert, und so fort. Eine solche Proteasekaskade ist das Komplementsystem, das eine wichtige Komponente der sogenannten angeborenen Immunität darstellt. Ein Auslöser der Komplementkaskade ist der Komplementkomplex C1, welcher die weiteren Komponenten des Komplementsystems aktiviert und sowohl zur direkten Abwehr gegen Bakterien beitragen, als auch weitere Teilnehmer des Immunsystems wie Abwehrzellen anlocken und entzündliche Prozesse modulieren kann.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, Verfahren und Mittel zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, die physiologisch wirksame Komponente Urotensin-2-Konvertase, welche Urotensin-2-Vorläuferpeptide in Urotensin umwandelt, zu identifizieren und zu isolieren. Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, geeignete Verfahren zur Ermittlung von Aktivitäten zur Modulation von Urotensin-2-Konvertase (UCE-Aktivitäten) zu finden.

Gelöst wird diese Aufgabe durch das Verfahren der Hauptansprüche.

Ausgangspunkt der Identifizierung und Isolierung der UCE-Aktivität ist die Untersuchung von menschlichem Blutplasma. Alternativ können auch andere, dem Fachmann zugängliche Gewebe herangezogen werden.

Blutplasma kann in verschiedene Fraktionen aufgeteilt werden, man spricht von Cohn-Fraktionen Die in diesem Zusammenhang verwendete Nomenklatur geht auf den amerikanischen Arzt und Biochemiker Edwin Joseph Cohn zurück. Es wurde in den Beispielen der vorliegenden Erfindung mit der Cohn-IV-Fraktion gearbeitet.

Zusammenfassend beruht die erfindungsgemäße Identifikation von Verbindungen, welche Proteine mit Urotensin-2-Konvertase-Aktivität hemmen können, auf zwei Schritten: zunächst wird ein Protein mit Urotensin-2-Konvertase-Aktivität durch Chromatographie aufgereinigt, und in einem zweiten Schritt wird das gereinigte Protein auf seine Aktivität in Anwesenheit der zu untersuchenden Verbindungen getestet.

Eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 1 dargestellt.

Die Aufreinigung durch Chromatographie erfolgt vorzugsweise durch eine Kombination von verschiedenen Chromatographieschritten. Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination von Anionen-, hydrophober Interaktions- und Kationenchromatographie. Für jeden Chromatographieschritt muss eine eigene Optimierung der Parameter vorgenommen werden, was mit erheblichem experimentellen Aufwand verbunden ist.

Die Identifikation der optimalen Chromatographieparameter wurde mit dem Proteinreinigungs-Parameter-Suchsystem („Protein Purification Parameter Screening System", PPS) durchgeführt. PPS ist eine Methode zur Bestimmung optimaler Parameter für Chromatographiesysteme, bei welchem ein Parameterraum, bestehend z.B. aus Ionenstärke oder pH der mobilen Phase sowie verschiedenen stationären Phasen systematisch nach optimalen Reaktionsparameterkombinationen abgesucht wird (Thiemann et al., J Chromatogr A. 2004 Jul 16;1043(1):73–80) (siehe Beispiel 2).

Für den Nachweis einer Enzymaktivität, welche UII aus einem Vorläufermolekül zu generieren vermag und welche im weiteren mit UCE-Aktivität bezeichnet wird, musste zuerst ein geeignetes Substrat gefunden werden, welches zum einen eine Schnittstelle für das UCE besitzt und zum anderen zwei Cysteine, die über eine Disulfidbrücke verbunden sind und ein zyklisches Peptid bilden können. Ausgehend vom natürlich vorkommenden Präpro-UII wurde eine Teilsequenz mit 21 Aminosäuren synthetisiert (SEQ ID NO 02) (Fa. Wita GmbH, D-14513 Teltow/Berlin). Zur Herstellung der intramolekularen Disulfidbrücke erfolgte nach der Festphasen-gekoppelten Synthese eine Oxidation der Cysteingruppen des Peptids. Dieses Peptid wird im Weiteren als UCE-S (UCE-Substrat) bezeichnet und hat die Sequenz Arg-Ile-Trp-Lys-Pro-Tyr-Lys-Lys-Arg-Glu-Thr-Pro-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val.

Zur Analyse der UCE-Aktivität wurde in der vorliegenden Erfindung ein Nachweissystem etabliert. Der Nachweis von UCE-Aktivität kann erfindungsgemäß mit Hilfe des sog. Massenspektrometrie–gestützten Enzym-Screenings (MES) (Schlüter, Anal Bioanal Chem. 2003 Dec; 377(7-8):1102–7) erfolgen.

Im Verlauf der Arbeit an der vorliegenden Erfindung hat sich menschliches Blutplasma als geeignete Quelle von Ausgangsmaterial für UCE-haltige Proteinproben erwiesen. 2 zeigt das Ergebnis eines Ultrazentrifugationsversuches mit Filtern unterschiedlicher Ausschlussgrenzen (10 kDa, 30 kDa, 50 kDa und 100 kDa). Die erhaltenen Filtrate und Retentate wurden mit dem MES-Assay auf ihre UII-generierende Aktivität untersucht. Im Retentat des 50 kDa-Filters ist die höchste UCE-Aktivität zu finden, was zeigt, dass das UCE ein Molekulargewicht zwischen 50 und 100 kDa besitzt.

Nachfolgend wurden für eine mögliche Vorfraktionierung unterschiedliche Cohn-Fraktionen, die alle aus humanem Plasma fraktioniert wurden, auf eine UCE-Aktivität überprüft. 3 zeigt die Ergebnisse des MES-Assays auf UCE-Aktivität für unterschiedliche humane Plasma-Cohn-Fraktionen. Die Cohn-IV-Fraktion zeigt die höchste UCE-Aktivität und wurde für die weitere Reinigung des UCE verwendet.

Die Ermittlung der Chromatographiebedingungen erfolgt gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung über PPS (siehe oben). Es werden zu Beginn einer jeden Chromatographie Experimente durchgeführt, mit denen unterschiedliche Parameter auf ihre Eignung für die Reinigung des UCE überprüft werden können. Ein Beispiel für die Durchführung der Optimierung und ihre Ergebnisse ist Beispiel 2 zu entnehmen. Die aus den PPS-Experimenten erhaltenen Parametersätze werden anschließend auf die Säulenchromatographie übertragen.

Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zur Reinigung der Plasmafraktion zum Zwecke des erfinderischen UCE-Aktivitätsassays drei Chromatographien durchgeführt, eine Sample-Displacement Anionenaustauschchromatographie mit einer stationären Aminoethylphase und einem Ladungspuffer von pH7, eine auf dem Prinzip der hydrophoben Interaktion beruhende Chromatographie mit der festen Phase t-Butyl-MacroPrep-Gel mit einem Probenauftragspuffer bei pH5, und eine Kationenaustauschchromatographie mit einer stationären Phase UnosphereS-Gel bei einem pH-Wert von 5. Die zusammengefassten Fraktionen mit der höchsten UCE-Aktivität werden für den nachfolgenden Aktivitätsassay über einen 10 kDa Filter eingeengt.

Erfindungsgemäß kann mit der wie vorstehend beschrieben isolierten UCE-Aktivität enthaltenden Proteinpräparation ein Assay durchgeführt werden, der die Eignung verschiedener chemischer Verbindungen zur Modulation, insbesondere zur Inhibition, der UCE-Aktivität untersucht. Als chemische Verbindung im Sinne dieser Erfindung werden niedermolekulare Verbindungen, Peptide und Proteine mit oder ohne kovalente Modifikationen durch nicht in den klassischen Proteine bildenden Aminosäuren enthaltene Gruppen sowie Polymere und Gemische der vorgenannten Verbindungen verstanden. Zur Illustration dieses Prinzips wird im Beispiel 3 ein Experiment zur Untersuchung der Verbindungen L-trans-epoxysuccinyl-leucyl amido(4-guanidino)butan (E64), Isovaleryl-Val-Val-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-Ala-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure (Pepstatin A), Ethyldiamintetraessigsäure, ([(2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl]-L-leucin) (Bestatin), [(S)-1-Carboxy-2-phenylethyl]-carbamoyl-a-[2-amidohexahydro-4(S)-pyrimidyl]-(S)-glycyl-[A = Leu; B = Val; oder C = Ile]-phenylalaninal (Chymostatin) und 4-(2-Aminoethyl) benzensulfonylfluorid hydrochlorid (AEBSF) gezeigt. Die Bestimmung der modulierenden Wirkung der zu untersuchenden Substanz kann direkt oder durch Vergleich mit einem Standard erfolgen. Das Ergebnis eines solchen erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 6 dargestellt.

Weiterhin ist erfindungsgemäß eine Identifizierung des gereinigten Proteins durch einen weiteren Affinitätschromatographieschritt sowie die nachfolgende Analyse der aufgereinigten Proteine vorgesehen. Vorteilhafterweise erfolgt diese durch Massenspektrometrie, insbesondere durch Flüssigkeitschromatographie-gekoppelte Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LC-ESI MS/MS).

Dazu wird Chymostatin an die feste Phase EAH-Sepharose mittels EDC-Linker kovalent gebunden (siehe Beispiel 4). Das Affinitätsgel wird anschließend für die Säulen-Affinitäts-Chromatographie eingesetzt. Das Eluat wird durch Größenausschluß-Gelseparation getrennt, tryptisch verdaut anschließend mittels LC-ESI-MS/MS identifiziert (siehe Beispiel 5).

Mit Hilfe eines bioinformatorischen Datenverarbeitungsprogramms kann in der Folge das in der UCE-Aktivität enthaltenden Probe vorliegende Protein identifiziert werden (siehe Beispiel 5). Im vorliegenden Beispiel wurde der humane Komplement Faktor I (EC-Nummer: 3.4.21.45) identifiziert.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls ein durch Reinigung und nachfolgende Charakterisierung identifiziertes Protein in einer durch ein anderes Verfahren gereinigten Form oder in rekombinanter Form als Substrat in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifikation von Hemmstoffen der UCE-Aktivität eingesetzt werden. Zur Verifikation der Identität des aufgereinigten und charakterisierten Proteins mit der durch ein anderes Verfahren gereinigten oder rekombinanten Form zur Verfügung gestellten Form wird zunächst ein massenspektrometrischer Vergleich der durch Verdau entstehenden Peptidfragmente der jeweiligen Proteine vorgenommen, so gezeigt im Beispiel 5 für den Komplement-Faktor 1.

Untersuchungen zur Hemmung der UCE-Aktivität einer kommerziell erworbenen Komplement-Faktor-1-Präparation können erfindungsgemäß zur Identifikation von potentiellen UCE-Modulatoren (siehe Beispiel 6) eingesetzt werden. Ebenso sind Proteine einsetzbar, die eine mit Komplement-Faktor 1 oder einer mit der unter der Zugangsnummer P05156 in der Proteindatenbank Swissprot abgelegten Proteinsequenz zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 70%, weiter bevorzugt zu mindestens 80%, noch weiter bevorzugt zu mindestens 90% homologe Sequenz aufweisen.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren der Zeichnungen an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifikation von Urotensin-2-Konvertase-Inhibitoren gemäß Anspruch 1 bis 6

2 Ergebnisse der relativen Molekulargewichtsbestimmung des UCE mittels Zentrifugenfilter unterschiedlicher Ausschlussgrößen. X-Achse: Filtrate und Retentate der Filter mit den unterschiedlichen Ausschlussgrößen. Y-Achse: UCE-Aktivität.

3 Ergebnisse der Suche nach einer UCE-Aktivität in unterschiedlichen humanen Plasma-Cohn-Fraktionen. Unterschiedliche Cohn-Fraktionen aus humanem Plasma wurden an Affinitätsbeads immobilisiert und mittels MES-Assay die UCE-Aktivität bestimmt. X-Achse: unterschiedliche Cohn-Fraktionen aus humanem Plasma. Y-Achse: UCE-Aktivität.

4 ein typisches Massenspektrum der Reaktionsprodukte aus der Inkubation einer Plasma-Cohn-IV-Fraktion mit UCE-S: MALDI-Spektren der Inkubationsreihe mit UCE-Substrat (UCE-S) und den gebildeten Reaktionsprodukten nach Immobilisierung einer humanen Plasmafraktion (Cohn-IV-Fraktion) nach unterschiedlichen Inkubationszeitpunkten. UII: 1389.56 Da, R-UII=Arg-UII: 1545.66 Da, KR-UII=Lys-Arg-UII: 1673.75 Da, UCE-S: 2645.3 Da, V:Verunreinigung: 2230.95 Da

5 ein Chromatogramm der Größenausschluss-Chromatographie der UCE-Aktivität der Fraktion 1.4 aus der Affinitätschromatographie. Probenvolumen: 200 μl. Säule: Superdex 200HR 10/30. Puffer A: 50 mM Phosphatpuffer in 150 mM NaCl; pH 7. Flußrate: 250 μl/min. X-Achse: Retentionsvolumen [ml]. Y-Primärachse: Absorption bei 280 nm. Y-Sekundärachse: Leitfähigkeit [mS/cm].

6 die Ergebnisse der Inhibitionstests der UCE-aktiven Fraktionen 1.3 aus der Kationenaustausch-Chromatographie. Probenvolumen: 50 μl. Inhibitorenkonzentrationen: 10 μM E64, 10 μM Pepstatin A, 1 mM EDTA, 100 μM Bestatin, 10 μM Chymostatin und 1 mM AEBSF

7 MES-Assay für den Nachweis der UII-generierenden Aktivität des Komplement Faktor I (A) und der gereinigten Fraktion 1.5B (B) aus einer humanen Cohn IV-Fraktion: MALDI-Spektren der Inkubation mit UCE-S und den gebildeten Reaktionsprodukten nach Immobilisierung der kommerziellen Präparation des Komplement Faktor I und der gereinigten Fraktion 1.5B einer CohnIV-Fraktion aus humanem Plasma nach einer Inkubationszeit von 7h. UII: 1389.56 Da, R-UII: 1545.66 Da, KR-UII: 1673.75 Da, UCE-S: 2645.3 Da, V:Verunreinigung: 2230.95 Da

8 Fluoreszenzassay zum Nachweis einer proteolytischen Aktivität der Fraktion 1.5B aus der Gelfiltration (b) und einer gekauften Komplement Faktor I-Fraktion (c).

9 MALDI-Spektren der Glykoproteincharakterisierung mittels Mannose-Glykoprotein Kit mit immobilisierten GNA (Schneeglöckchen Lektin) der Fraktion 1.5B und der kommerziellen Komplement Faktor I-Fraktion. A: Eluat der 1.5B-Fraktion B: Eluat des Komplement Faktor I. C: Überstand der 1.5B-Fraktion. D: Überstand des Komplement Faktor I.

10 MALDI-Spektren der der Reaktionsprodukte nach Inkubation mit UCE-S und Pefabloc SC nach 24h Inkubation. A (oben): immobilisierte 1.56-Fraktion. B (unten): immobilisierte Komplement Faktor I-Präparation. UCE-S: 2645.3 Da. V=Verunreinigung: 2230.95 Da. X=Peptid Lys-Lys-Arg-UII 1801.8 Da.

11 MALDI-Spektren der Reaktionsprodukte nach Inkubation mit UCE-S und Aprotinin nach 24h Inkubation. A: immobilisierte 1.5B-Fraktion. B: immobilisierte Komplement Faktor 1-Präparation. UCE-S: 2645.3 Da. V=Verunreinigung: 2230.95 Da. X=Peptid Lys-Lys-Arg-UII 1801.8 Da.

BeispieleGenerelle Informationen zu Materialien und Methoden:

Verwendete Chromatographiematerialien: Butyl-650-Gel (), Buthyl-Sepharose (GE Healthcare), DEAE-650M-Gel (Tosoh), EAH-Sepharose (GE Healthcare), Ether-650-Gel, Fractogel COO (Merck), Fractogel DEAE (Merck), Fractogel SO3 (Merck), Fractogel TMAE (Merck), Methyl MacroPrep-Gel (Biorad), Phenyl-650-Gel (Tosoh), Phenyl-Sepharose (GE Healthcare), QAE-550C-Gel (Tosoh), Q-Sepharose FF (GE Healthcare), Sepharose 6MB (GE Healthcare), SP-Sepharose FF (GE Healthcare), SuperQ-650M-Gel (Tosoh), t-Butyl MacroPrep-Gel (Biorad), Toyopearl CM-650M-Gel (Tosoh), Unosphere S-Gel (Biorad), Unosphere Q-Gel (Biorad),

Verwendete Säulengehäuse für die Säulenchromatographien

Die Reinigung des UCE-Substrats wurde mit der 5 RPC-Säule 4.1 × 150 mit Stahlgehäuse durchgeführt. Für die Hydrophobe Interaktionschromatographie wurde mit das XK-Säulengehäuse der Firma GE Healthcare eingesetzt. Für die Kationenaustauschchromatographie wurde mit der vorgepackten S6-Säule mit Unosphere S-Gel der Firma Biorad gearbeitet. Für die Affinitätschromatographie wurde das HR 10/30 Säulengehäuse der Firma GE Healthcare verwendet und für die Größenausschlußchromatographie mit der Superdex 200HR 10/30 von GE Healthcare chromatographiert.

Geräte

Für den MES-Assay wurde das Massenspektrometer Reflex III MALDI-TOF der Firma Bruker benutzt. Aliqouts der Inkubationsansätze aus dem MES-Assay wurden auf den MTP AnchorChip 384/400 von Bruker pipettiert. Die Immobilisierung der Proben erfolge auf dem Überschlagsrotor Rotator Drive STR4 von Stuart Scientific. Für die Substratinkubation wurde der Schüttler von Fisher Bioblock Scientific verwendet. Die Chromatographien wurden an den HPLC Anlagen (Explorer und Purifier) von der Firma GE Healthcare durchgeführt. Die PPS-Experimente wurden mit dem Genesis Freedom 200 der Firma Tecan durchgeführt. Für die mit dem Dispenser Multidrop DW der Firma Thermo Electron befüllten Pufferplatten für die PPS-Experimente wurden 1,2 ml Storage DeepWell Platten der Firma ABGene verwendet. Für den MES-Assay wurden 500 μl Eppendorfgefäße und Microtestplatten 96 Well K der Firma Sarstedt benutzt. Die pH-Werte wurden mit der InLab®422 Combination Semi-micro pH Electrode von METTLER TOLEDO gemessen. Für die Proteinbestimmung der Eluate und Überstände aus den PPS-Experimenten wurde der UV-Reader Genios der Firma Tecan eingesetzt. Alle weiteren Proteinkonzentrationen wurden mit dem Photometers iEMS Reader MF von Thermo Labsystems bestimmt. Die Einengung der Proteinfraktionen wurde in Amicon Ultra Zentrifugenfiltern der Ausschlussgrenze von 10 kDa der Firma Millipore durchgeführt und mit der Multifuge 3 S-R von Heraeus zentrifugiert. Die Vorbereitung der Proben ab der 2. Chromatographie erfolgte unter der Sterilbank LaminAir von Holten. Die Identifizierung der tryptischen Peptide erfolgte mit der LC-ESI MS/MS der Firma Agilent und dem Chip XXX

Beispiel 1: MES-Assay

Der MES-UCE-Assay basiert auf der kovalenten Immobilisierung von Proteinfraktionen an Festkörperpartikel. Die immobilisierten Proteine werden mit dem UCE-S inkubiert, nach 2h, 5h und 24h werden Proben aus dem Reaktionsgefäß abgenommen und massenspektrometrisch vermessen. 4 zeigt ein typisches Massenspektrum der Reaktionsprodukte aus der Inkubation einer Plasma-Cohn-IV-Fraktion mit UCE-S. Es lässt sich die Abnahme des UCE-S und die Bildung des UII als Funktion der Zeit verfolgen. Nach einer Inkubationszeit von 5h ist das UCE-S vollständig abgebaut. In den Massenspektren sind zwei weitere Peaks (gekennzeichnet mit KR-UII und R-UII) feststellbar, welchen anhand der von den Peaks repräsentierten Massen eine molekulare Struktur zugeordnet werden kann: R-UII besitzt ein zusätzliches Arginin und KR-UII ein Lysin und ein Arginin am N-Terminus im Vergleich mit UII. Die Verunreinigung V kann nicht eindeutig einer Peptidsequenz zugeordnet werden. Es handelt sich hierbei um ein Peptid-Molekül, dass wahrscheinlich während der Peptidsynthese entstanden ist.

Ausgehend vom humanen Präpro-UII wurde eine Teilsequenz RIWKPYKKRETPDCFWKYCV mit UII-Schnittstelle synthetisiert (Wita GmbH). Das UCE-S Peptid wurde in 100 mM Ammoniumacetat; pH 7 aufgenommen, auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml eingestellt und 48h inkubiert. Die Lösung wurde anschließend auf 0,1% TFA eingestellt und auf eine Reversed Phase Säule 5RPC 4.1 × 150 aufgetragen. Als mobile Phase wurde eine 0,1%ige TFA Lösung (Puffer A) und 80% ACN (Puffer B) verwendet. Die Reversed-Phase-Chromatgraphie (RPC) wurde bei einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt. Der Gradient verlief von 0% B auf 50% B in 40 Minuten. Es wurden Fraktionen von 10 ml gesammelt. Gewonnene Peptid-Fraktionen der RPC wurden bei minus 80°C eingefroren und anschließend in der Vakuumzentrifuge Savant SPD111V getrocknet. Auf einen MTP AnchorChip wurde 1 μl DHB-Matrix-Lösung (30mg/ml DHB in 50% ACN) aufgetragen und eingetrocknet. Die getrockneten Peptide wurden in 1000 μl destilliertem Wasser gelöst und 1 μl dieser Lösungen auf die eingetrocknete Matrix pipettiert. Nach dem Trocknen der Proben, wurden diese massenspektrometrisch vermessen. Peptid-Fraktionen die bei 2645,3 Da ein Signal mit normaler Isotopenverteilung zeigten und keine Peaks, die auf Verunreinigungen schließen lassen, aufwiesen, wurden für die weiteren Experimente verwendet.

Immobilisierung der Proteinfraktionen

Die Immobilisierung der Proteinfraktionen erfolgte an die Affinitätsbeads BrCN-aktivierte Sepharose 6MB. Für die Immobilisierung wurde eine entsprechende Menge an trockenen Beads aus dem Vorratsgefäß abgenommen und in ein Eppendorfgefäß überführt. Zum Quellen der Beads wurde ca. das 100-fache Volumen einer 1 mM HCl-Lösung zugegeben und die Mischung auf einem Überschlagsrotor ca. 1 h Stunde inkubiert. Von den Beads wurde die überschüssige HCl-Lösung entfernt und 3mal mit Wasser gewaschen. Für die Immobilisierung von Proteinfraktionen wurden jeweils 30 μl Beads portioniert. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Wasser entfernt und die Beads einmal mit Kopplungspuffer (100 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, pH8,3) gewaschen. Dieser wurde anschließend von den Beads entfernt. Es wurden 30 μl Proteinlösung mit 30 μl Kopplungspuffers gemischt und zu den Beads pipettiert. Die Kopplung erfolgte 2h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C auf einem Überschlagsrotor. Nach der Kopplung wurde die Lösung von den Beads entfernt und 100 μl Blockierungspuffer (100 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, 100 mM Glycin, pH 8,3) zugegeben und 2h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C auf einem Überschlagsrotor inkubiert. Nach der Blockierung wurden die immobilisierten Proteine 3mal mit Wasser gewaschen.

Inkubation der immobilisierten Proteinfraktionen mit dem UCE-Substrat

Von den Beads mit den immobilisierten Proteinfraktionen wurde das Wasser vom vorigen Waschschritt entfernt und 30⎕l einer 10–5M UCE-Substratlösung zugegeben. Die Inkubation erfolgte auf einem Schüttler. Auf ein MTP AnchorChip wurde 1 μl einer DHB-Matrix-Lösung pipettiert. Nach dem Eintrocknen der Matrix wurden nach definierten Zeitpunkten 3 × 2⎕l Aliquots der Reaktionsmischung abgenommen und auf den MTP AnchorChip pipettiert. Nachdem die Proben eingetrocknet waren, wurden Massenspektren der Proben aufgenommen.

Semiquantitativer Nachweis der Reaktionsprodukte mittels MALDI-Massenspektrometrie

Für den semiquantitativen Nachweis des Reaktionsproduktes UII wurde für jedes Massenspektrum das Verhältnis der Signalintensitäten von UII bei einem Massensignal von 1389.56 Da zu UCE-S bei einem Massensignal von 2645.3 Da gebildet. Aufgrund der n=3-Messung wurde von den 3 Proben jeweils der Mittelwert der Intensitätsverhältnisse gebildet. Die gemittelten Intensitätsverhältnisse wurden von allen Zeitpunkten zusammenaddiert und der erhaltene Wert wurde als UII-generierende Aktivität angegeben. Alle Schritte wurden mit einem Visual Basic Skript automatisch ausgeführt.

Beispiel 2: Proteinreinigungs-Parameter-Suchsystem

PPS hilft, in kurzer Zeit optimale Wege zur chromatographischen Reinigung definierter Proteine zu finden. 96 und mehr verschiedene Parameter, wie pH-Werte, stabilisierende Zusätze oder Salzkonzentrationen, können auf ihre Auswirkung auf die Reinigung von Proteinen untersucht werden. Das PPS-System ist ein automatisiertes, multiparalleles System, das auf der Batch-Chromatographie basiert.

Das Verfahren umfasst sechs Schritte:

  • 1. Zu Beginn der PPS-Experimente werden die zu testenden Chromatographie-Gele in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen eingebracht.
  • 2. Die Probenaufgabe-Puffer-Platte, z.B. für PPS-Ionenaustausch-Chromatographie-Experimente, wird hergestellt. Dazu werden auf der X-Achse einer 96er-Platte pH-Werte, auf der Y-Achse Salzkonzentrationen variiert. Dann werden die Gele mit individuellen Puffern equilibriert, indem Kopien der Puffer der Probenaufgabeplatte auf die Gelplatte überführt werden.
  • 3. Der Probenauftrag erfolgt. Probe, Probenaufgabepuffer und Gel werden über definierte Zeitintervalle in Suspension gehalten. Anschließend sedimentiert das Gel. Die 96 Überstände werden abgenommen und quantitativ analysiert.
  • 4. Das Gelsediment wird mehrfach gewaschen, um die nicht bindenden Moleküle von den ans Gel adsorbierten Proteinen zu entfernen.
  • 5. Zur Freisetzung der gebundenen Proteine werden die gewaschenen Gelsedimente mit einem Elutionspuffer versetzt. Nun erfolgt die quantitative Analyse der 96 Eluate.
  • 6. Die Resultate der Protein-Konzentrationsbestimmungen werden in einer PPS-Ergebnismatrix dargestellt, die Angaben zur Gesamt-Protein-Konzentration, zur absoluten und zur spezifischen Ziel-Protein-Konzentration enthält. Aus der Ergebnismatrix werden Empfehlungen zur chromatographischen Reinigung des Zielproteins abgeleitet.

Für die Durchführung der PPS-Experimente mussten insgesamt 5 96-Deepwell-Platten vorbereitet werden. Insgesamt wurden 8 unterschiedliche Anionenaustauschergele bei 5 verschiedenen pH-Werten getestet. Daraus ergab sich eine Anzahl von 40 unterschiedlichen Parametern. Die Lösungen und Gele wurden jeweils beginnend von Position A1 bis H5 der 96-Deepwell-Platte befüllt. Für die Vorbereitung der Gelplatte wurden 10 ml der Gele Fractogel TMAE, Fractogel DEAE, SuperQ-650M, DEAE-650M, QAE-550C, Streamline DEAE, Q-Sepharose FF und Unosphere Q abgenommen und in ein 50 ml Greihner-Röhrchen überführt, mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 1M NaCl-Lösung konditioniert. Danach wurden die Gele 3mal mit Wasser gewaschen, in einen Messzylinder überführt und eine 1:1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt. Diese wurde in ein Greihner-Röhrchen überführt. Nachdem durch mehrmaligen Schwenken eine homogene Suspension entstand, wurden 20 μl der Suspension in das entsprechende Well pipettiert.

12345AFractogel
TMAE
Fractogel
TMAE
Fractogel
TMAE
Fractogel
TMAE
Fractogel
TMAE
BFractogel
DEAE
Fractogel
DEAE
Fractogel
DEAE
Fractogel
DEAE
Fractogel
DEAE
CSuperQ-650MSuperQ-650MSuperQ-650MSuperQ-650MSuperQ-650MDDEAE-650MDEAE-650MDEAE-650MDEAE-650MDEAE-650MEQAE-550CQAE-550CQAE-550CQAE-550CQAE-550CFStreamline
DEAE
Streamline
DEAE
Streamline
DEAE
Streamline
DEAE
Streamline
DEAE
GQ-Sepharose
FF
Q-Sepharose
FF
Q-Sepharose
FF
Q-Sepharose
FF
Q-Sepharose
FF
HUnoshereQUnoshereQUnoshereQUnoshereQUnoshereQ
Tab. 1: Gelplatte mit jeweils 10 μl Gelsediment pro well. XY-Achsen zeigen die Positionen der 96-Deepwell-Platte an

Für die Herstellung der Pufferplatten wurden von jedem Puffer jeweils 50 ml einer 50 mM Lösung hergestellt und auf die gewünschten pH-Werte mit NaOH bzw. HCl eingestellt. Mit Hilfe eines Dispensers wurden automatisch die Probenauftragspufferplatte und die Equilibrierungs/Waschplatte mit den gewünschten Puffern befüllt.

12345APiperazin
pH6
Bis-Tris-Propan
pH7
N-Methyl-diethanolamin pH8CHES
pH9
CAPS
pH10
BPiperazin
pH6
Bis-Tris-Propan
pH7
N-Methyl-diethanolamin pH8CHES
pH9
CAPS
pH10
CPiperazin
pH6
Bis-Tris-Propan
pH7
N-Methyl-diethanolamin pH8CHES
pH9
CAPS
pH10
DPiperazin
pH6
Bis-Tris-Propan
pH7
N-Methyl-diethanolamin pH8CHES
pH9
CAPS
pH10
EPiperazin
pH6
Bis-Tris-Propan
pH7
N-Methyl-diethanolamin pH8CHES
pH9
CAPS
pH10
FPiperazin
pH6
Bis-Tris-Propan
pH7
N-Methyl-diethanolamin pH8CHES
pH9
CAPS
pH10
GPiperazin
pH6
Bis-Tris-Propan
pH7
N-Methyl-diethanolamin pH8CHES
pH9
CAPS
pH10
HPiperazin
pH6
Bis-Tris-Propan
pH7
N-Methyl-diethanolamin pH8CHES
pH9
CAPS
pH10
Tab. 2: Probenauftragspufferplatte und Equilibrierungs-& Waschputterplatte mit jeweils 500 μl 50 mM individuelle Puffer pro well.

Die Elutionsplatte wurde mit einer 1 M NaCl-Lösung befüllt. In der Probenplatte befand sich in den Wells A1-D1 jeweils 500 μl einer 1 mg/ml CohnIV-Fraktionslösung. Nach der Herstellung aller Platten für die PPS-Experimente wurden diese auf der Pipettierroboterplattform positioniert und die PPS-Experimente automatisch durchgeführt (siehe 2.2.3). Die Elution erfolgte 4mal mit 30 μl Elutionspuffer. Die Eluate wurden dann anschließend mittels MES-UCE-Assay auf ihre UCE-Aktivität untersucht. 100 μl der Eluate wurden an 30 μl Sepharosebeads immobilisiert, inkubiert und die Aliquots massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel 1).

Reinigung von UCE mittels Anionenaustausch-Sample Displacement Chromatographie: 600 ml QAE-550C-Gel wurden abgenommen und einmal mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 1 M NaCl-Lösung konditioniert. Das konditionierte Gel wurde dann 3mal mit Wasser gewaschen. Das gewaschene Gel wurde mit dem 50 mM bis-Tris-Propan-Puffer bei pH7 (Puffer A) equilibriert und anschließend gleichmäßig auf 10 Glasflaschen verteilt. 2g der Cohn IV-Fraktion wurden in 100 ml Puffer A aufgenommen und mit dem Gel in der ersten Flasche vermischt. Nach Sedimentation des Gels wurde der Überstand abgenommen und in die zweite Flasche überführt und mit dem Gel vermischt.

Dieser Vorgang wurde solange wiederholt bis alle 10 Gelaliquots mit den Überständen der vorigen Chromatographie vermischt worden sind. Die 10 Gelaliquots wurden mit jeweils 50 ml Puffer A 3mal gewaschen. Gelaliquots von 1 ml wurden abgenommen und es erfolgte eine 3fach Elution von jeweils 1 ml mit einer 1 M NaCl-Lösung (Puffer B). 100 μl des Eluats wurden an 50 μl Seharosebeads immobilisiert und die UII-generierende Aktivität bestimmt (siehe Beispiel 1). Nach Auswertung der Ergebnisse aus der Teilelution der 10 Gele wurde die gesamte Probe vom Gel der Flasche 1 3mal mit jeweils 50 ml Puffer B eluiert (bezeichnet als Fraktion 1.1).

Suche nach geeigneten Parametern für die chromatographische Reinigung von UCE nach einer Sample-Displacement-Chromatographie: Für die Durchführung der PPS-Experimente mussten insgesamt 5 96-Deepwell-Platten vorbereitet werden. Folgende Gele wurden verwendet: ein Metallchelatgel (IMAC) mit jeweils 6 unterschiedlichen Metallionen beladen, 8 verschiedene Hydrophobe Interaktionsgele (Super-Butyl 550, Butyl-650, Buthyl-Sepharose, t-Butyl MacroPrep-Gel, Methyl MacroPrep-Gel, Phenyl-650-Gel, Phenyl-Sepharose, Ether-650-Gel). Bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie wurden zusätzlich zu den unterschiedlichen Gelen auch 5 pH-Werte variiert. Die Lösungen und Gele wurden jeweils beginnend von Position A1 bis Position F8 der 96-Deepwell-Platte befüllt. Für die Vorbereitung der Gelplatte wurden 1 ml der oben aufgeführten Gele abgenommen und in ein Eppendorfgefäß überführt, mit Wasser gewaschen und anschliessend mit einer 1 M NaCl-Lösung konditioniert. Danach wurden die Gele 3mal mit Wasser gewaschen und eine 1:1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt. Nachdem durch mehrmaligen Schwenken eine homogene Suspension entstanden war, wurden 20 μl der Suspension in das entsprechende Well pipettiert.

12345678AFe-IMACZn-IMACCu-IMACMg-IMACNi-IMACMn-IMACBSuper-Butyl 550Butyl-650Butyl-Sepharoset-Butyl MacroPrepMethyl-MacroPrepPhenyl-650Phenyl-SepharoseEther-650CSuper-Butyl 550Butyl-650Butyl-Sepharoset-Butyl MacroPrepMethyl-MacroPrepPhenyl-650Phenyl-SepharoseEther-650DSuper-Butyl 550Butyl-650Butyl-Sepharoset-Butyl MacroPrepMethyl-MacroPrepPhenyl-650Phenyl-SepharoseEther-650ESuper-Butyl 550Butyl-650Butyl-Sepharoset-Butyl MacroPrepMethyl-MacroPrepPhenyl-650Phenyl-SepharoseEther-650FSuper-Butyl 550Butyl-650Butyl-Sepharoset-Butyl MacroPrepMethyl-MacroPrepPhenyl-650Phenyl-SepharoseEther-650
Tab. 3: Gelplattenbelegung. 10 μl Gelsediment pro Well. Position A1-6 IMAC-Gel beladen mit entsprechenden Metallion. Position B1-F8 unterschiedliche HIC-Gele.

Die Pufferplatten wurden durch Mischen der einzelnen Lösungen (Pufferlösungen, NaCl-Lösung und Wasser) auf die entsprechende Konzentration (wie in Tab. 4 dargestellt) eingestellt. Die Befüllung erfolgte mit Hilfe eines Dispensers. In die Probenplatte wurden jeweils 500 μl der Fraktion 1.1 aus der Sample Displacement Chromatographie in die Positionen A1-D1 pipettiert. Danach erfolgte die automatische Durchführung der PPS-Experimente mit dem Pipettierroboter-System. Es wurde 6mal mit 30 μl des Elutionspuffers eluiert.

12345678A50 mM Na-Phosphat; 1 M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 1 M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 1 M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 1 M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 1 M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 1 M NaCl; pH7B50 mM Malonsäure 2M NaCl; pH550 mM Malonsäure 2M NaCl; pH550 mM Malonsäure 2M NaCl; pH550 mM Malonsäure 2M NaCl; pH550 mM Malonsäure 2M NaCl; pH550 mM Malonsäure 2M NaCl; pH550 mM Malonsäure 2M NaCl; pH550 mM Malonsäure 2M NaCl; pH5C50mM bis-Tris; 2M NaCl; pH 650 mM bis-Tris; 2M NaCl; pH 650 mM bis-Tris; 2M NaCl; pH 650 mM bis-Tris; 2M NaCl; pH 650 mM bis-Tris; 2M NaCl; pH 650 mM bis-Tris; 2M NaCl; pH 650 mM bis-Tris; 2M NaCl; pH 650 mM bis-Tris; 2M NaCl; pH 6D50mM Na-Phosphat; 2M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 2M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 2M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 2M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 2M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 2M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 2M NaCl; pH750 mM Na-Phosphat; 2M NaCl; pH7E50 mM HEPES;2M NaCl; pH850 mM HEPES; 2M NaCl; pH850 mM HEPES; 2M NaCl; pH850 mM HEPES; 2M NaCl; pH850 mM HEPES; 2M NaCl; pH850 mM HEPES; 2M NaCl; pH850 mM HEPES; 2M NaCl; pH850 mM HEPES; 2M NaCl; pH8F50 mM AMPSO; 2M NaCl; pH950 mM AMPSO; 2M NaCl; pH950 mM AMPSO; 2M NaCl; pH950 mM AMPSO; 2M NaCl; pH950 mM AMPSO; 2M NaCl; pH950 mM AMPSO; 2M NaCl; pH950 mM AMPSO; 2M NaCl; pH950 mM AMPSO; 2M NaCl; pH9
Tab.4: Zusammensetzung der Equilibrierungs/Waschpufferplatte und der Probenauftragspufferplatte. Pro Well 1 ml des individuellen Puffers.12345678A25 mM Na-Phosphat; 1M NaCl; pH425 mM Na-Phosphat; 1M NaCl; pH425 mM Na-Phosphat; 1M NaCl; pH425 mM Na-Phosphat; 1M NaCl; pH425 mM Na-Phosphat; 1M NaCl; pH425 mM Na-Phosphat; 1M NaCl; pH4B50 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH7C50 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH7D50 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH7E50 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH7F50 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH750 mM Na-Phosphat; pH7
Tab. 5: Zusammensetzung der Elutionspufferplatte. Pro Well 1 ml des individuellen Puffers.

Zweite Chromatographische Reinigung von UCE mittels Hydrophober Interaktionschromatographie: Ein XK50-Säulengehäuse wurde mit 150 ml t-Butyl MacroPrep-Gel gepackt und an das HPLC Explorer System angeschlossen. Mit einem Fluss von 10 ml/min wurde die Säule solange mit Puffer A (50 mM Malonsäure; 2M NaCl; pH5) equilibriert bis die Leitfähigkeit konstant blieb. Das Eluat (150 ml) der Sample Displacement Chromatographie bezeichnet als Fraktion 1.1 wurde mit 150 ml 100 mM Malonsäure vermischt und mit einer NaCl-Lösung auf 2M eingestellt. Der pH-Wert wurde mit einer HCl-Lösung auf einen Wert von 5 gebracht. Die Probe wurde mit einem Fluss von 10 ml/min mit der Sample Pump des Explorers auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde anschließend mit 200 ml Puffer A gewaschen. Der Gradient für die Elution der Probe verlief von 0% auf 100% B (Wasser) in 60 Minuten. Während der Chromatographie wurden 10 ml Fraktionen gesammelt. Nach 60 Minuten wurde 15 Minuten mit Wasser gespült. Von den Fraktionen mit einer deutlichen UV-Absorption bei 280 nm wurden 100 μl abgenommen und an Sepharosebeads immobilisiert, inkubiert und die UCE-Aktivität bestimmt.

Suche nach chromatographischen Parametern für die 3. chromatographische Reinigung des UCE: Für den nächsten Reinigungsschritt wurden 5 Kationenaustauschergele (Toyopearl CM-650M-Gel, Fractogel SO3, SP-Sepharose FF, Fractogel COO und UnosphereS-Gel) bei 5 verschiedenen pH-Werten getestet. Die Lösungen und Gele wurden jeweils beginnend von Position A1 bis Position E5 der 96-Deepwell-Platte befüllt. Für die Vorbereitung der Gelplatte wurden 1 ml der oben aufgeführten Gele abgenommen und in Eppendorfgefäße überführt, mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 1 M NaCl-Lösung konditioniert. Danach wurden die Gele 3mal mit Wasser gewaschen und eine 1:1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt. Nachdem durch mehrmaligen Schwenken eine homogene Suspension entstanden war, wurden 20 μl der Suspension in das entsprechende Well pipettiert. Die Elutionspufferplatte enthielt 500 μl einer 1 M NaCl-Lösung pro Well. Die Befüllung der Pufferplatten erfolgte mit dem Dispenser. Die Probenplatte enthielt in Position A1-D1 jeweils 500 μl der Fraktion 1.2 aus der Hydrophoben Interaktionschromatographie.

12345AToyopearl CM-650MFractogel SO3SP-Sepharose FFFractogel COOUnosphereSBToyopearl CM-650MFractogel SO3SP-Sepharose FFFractogel COOUnosphereSCToyopearl CM-650MFractogel SO3SP-Sepharose FFFractogel COOUnosphereSDToyopearl CM-650MFractogel SO3SP-Sepharose FFFractogel COOUnosphereSEToyopearl CM-650MFractogel SO3SP-Sepharose FFFractogel COOUnosphereS
Tab. 6: Gelplattenbelegung. Pro Well 10 μl Gelsediment. Position A1-E5 wurden mit Kationenaustauschergelen befüllt.12345A50 mM K2HPO4;
pH4
50 mM K2HPO4;
pH4
50 mM K2HPO4; pH450 mM K2HPO4; pH450 mM K2HPO4; pH4
B50 mM K2HPO4;
pH5
50 mM K2HPO4;
pH5
50 mM K2HPO4; pH550 mM K2HPO4; pH550 mM K2HPO4; pH5
C50 mM MES; pH650 mM MES; pH650 mM MES; pH650 mM MES; pH650 mM MES; pH6D50 mM MOPS; pH750 mM MOPS; pH750 mM MOPS; pH750 mM MOPS; pH750 mM MOPS; pH7E50 mM HEPES;
pH8
50 mM HEPES;
pH8
50 mM HEPES;
pH8
50 mM HEPES;
pH8
50 mM HEPES;
pH8
Tab. 7: Zusammensetzung der Equilibrierungs/Waschpufferplatte und der Probenauftragspufferplatte. Pro Well 1 ml des individuellen Puffers.

Dritte chromatographische Reinigung des UCE mittels Kationenaustausch-Chromatographie

Eine kommerzielle Uno S6-Säule vorgepackt mit dem Unosphere S-Material wurde an die HPLC Anlage Purifier angeschlossen und bei einem Fluss von 1 ml/min mit Puffer A (50 mM Phosphatpuffer, pH5) equilibriert. Das Volumen von 70 ml der 1.2-Fraktion aus der Hydrophoben Interaktionschromatographie wurde über 10 kDa-Filter auf ein Volumen von 500 μl eingeengt und mit 500 μl Puffer A gemischt. Die Probe wurde über eine 1 ml Probenschleife mit einem Fluss von 0,9 ml/min auf die Säule aufgetragen. Die Probenelution erfolgte bei einem Gradienten von 0% auf 100% B (1 M NaCl) in 40 Minuten. Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit einer signifikanten UV-Absorptin bei 280 nm wurden auf UII-generierende Aktivitäten getestet. Dabei wurden 100 μl Aliquots der Fraktionen an 30 μl Sepharosebeads immobilisiert (siehe 2.2.2.2), mit dem UCE-S inkubiert (2.2.2.3) und massenspektrometrisch vermessen (2.2.2.4). Die UCE-Fraktionen bezeichnet mit 1.3 wurden vereinigt und über einen 10 kDa-Filter konzentriert.

Beispiel 3: UCE-Aktivitätsassay

Folgende Proteaseinhibitoren wurden verwendet: 10 μM E64, 10 μM Pepstatin A, 1 mM EDTA, 100 μM Bestatin, 10 μM Chymostatin, 1 mM AEBSF (angegeben ist die Endkonzentration). Für den UCE-Aktivitätsassay wurden 7 × 30 μl Sepharosebeads (6 Inhibitoren + 1 Kontrolle) portioniert und jeweils 50 μl der Proteinfraktion 1.3 aus dem 3. chromatographischen Reinigungsschritt zugegeben. E64 und AEBSF als irreversible Inhibitoren wurden 30 Minuten vor Substratzugabe zu den immobilisierten 1.3 Proteinfraktionen pipettiert und bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach 30 Minuten wurde zu den Proben, die mit dem irreversiblen Inhibitoren inkubiert wurden, 27 μl des UCE-S (10-5 M) gegeben und bei RT geschüttelt. Von allen anderen Inhibitoren wurden 3 μl jeweils zu 27 μl des UCE-S gegeben, vermischt und zu den immobilisierten 1.3 Proteinfraktionen pipettiert und bei Raumtemperatur geschüttelt. Aliquots wurden nach 4h und 22h abgenommen und mittels MALDI-MS vermessen (siehe Beispiel 1). Das Ergebnis eines solchen erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 6 dargestellt.

Beispiel 4: Reinigung des UCE mit einer Affinitätschromatographie mit immoblisierten Chymostatin

Der nächste Reinigungsschritt bestand aus einer Affinitätschromatographie mit dem immobilisierten Inhibitor Chymostatin. Für diese Chromatographie wurden 20 ml EAH-Sepharose 3mal mit einer 500 mM NaCl-Lösung und anschließend mit einer mit 100 μM HCl-Lösung (pH 4,5) gewaschen. 400 mg des Crosslinkers EDC wurden in 100 μM HCl-Lösung (pH 4,5) gelöst und zu der EAH-Sepharose pipettiert. Anschließend wurden 100 μl einer 50 mg/ml Chymostatinlösung gelöst in DMSO zu der EAH-Sepharose gegeben und gut vermischt. Die Reaktion erfolgte bei 4°C über Nacht auf dem Überschlagsrotor. Die Kontrolle des pH-Werts erfolgte während der ersten 2h und wurde mit NaOH auf 4,5 eingestellt. Nach der Reaktion wurde der Überstand abgenommen und die EAH-Sepharose abwechselnd mit Puffer 1 (0,1 M Essigsäure, 500 m NaCl, pH 4) und Puffer 2 (0,1M Tris, 500mM NaCl, pH 8) jeweils 3mal gewaschen. Zum Abschluss wurde das Gel 3mal mit Wasser gewaschen. Für die Chromatographie wurden 2,7 ml der EAH-Sepharose mit immobilisierten Inhibitor Chymostatin in ein HR 10/30 Säulengehäuse gefüllt und an die HPLC-Anlage Purifier angeschlossen. Die Säule wurde mit Puffer A (50 mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 8) bei einem Fluss von 0,7 ml/min equilibriert. Die aufkonzentrierte Probe (500 μl der Fraktion 1.3 aus der Kationenaustauschchromatographie) wurde in 500 μl Puffer A aufgenommen und mit einem Fluss von 0,7 ml/min auf die Säule aufgetragen. Die Probenelution erfolgte bei einem Gradienten von 0% auf 75% Puffer B (50 mM Phosphatpuffer; pH 4) in 30 Minuten und weitere 30 Minuten auf 100% Puffer B. Während der Chromatographie wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Eine signifikante UV-Absorption bei 280 nm war nur im Durchbruch zu sehen, welcher dann auf die UII-generierende Aktivität überprüft wurde. Für die Immobilisierung wurden 100 μl des Durchbruchs an 30 μl Sepharose immobilisiert (siehe Beispiel 1). Nach Substratinkubation wurden die Proben massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel 1).

Reinigung des UCE mit einer Größenausschluss-Chromatographie: Die aktive Fraktion aus der Affinitätschromatographie, bezeichnet mit 1.4, wurde über einen 10 kDa-Filter auf ein Volumen von 100 μl eingeengt. Die Probe wurde in 100 μl Puffer A (50 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH 7) aufgenommen. Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR 10/30 wurde an die HPLC-Anlage Purifier angeschlossen. Die Probe wurde mit einem Fluss von 250 μl/min aufgetragen. Die Chromatographie wurde mit Puffer A durchgeführt. Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit einer deutlichen UV-Absorption bei 280 nm wurden immobilisiert und auf eine UCE-Aktivität getestet (Ergebnis siehe 5).

Beispiel 5: Identifizierung eines UCE-aktiven ProteinsTryptischer Verdau der UCE-aktiven Fraktionen aus der Größenausschluss-Chromatographie

Eine hohe UCE-Aktivität konnte in den Fraktionen 1.5A-D (siehe Chromatogramm der Größenausschluss-Chromatographie, 5) gefunden werden. Jeweils 800 μl der Fraktionen 1.5A-D wurden in Eppendorfgefäße überführt und eingefroren. Die gefrorenen Fraktionen wurden anschließend in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Die Pellets wurden in 50 μl 6M Harnstoff aufgenommen und 5 μl einer 200 mM DTT-Lösung, 100 mM NaHCO3 (pH 8,3) zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.

Zu dem Inkubationsansatz wurden 10 μl einer 200 mM Iodacetamid-Lösung, 100 mM NaHCO3 (pH 8,3) pipettiert und 1 h auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 10 μl einer 200 mM DTT-Lösung, 100 mM NaHCO3 (pH 8,3) zu dem Ansatz pipettiert und wieder 1 h auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 425 μl einer 100 mM NaHCO3-Lösung (pH 8,3) zugegeben und der Reaktionsansatz in ein Glasvial überführt. In das Glasvial wurden 5 μl einer 0,25 μg/ul Trypsin-Lösung pipettiert und 24h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wurde die Lösung mit Ameisensäure auf 0,1% eingestellt.

Identifizierung der tryptisch verdauten Peptide der UCE-aktiven Fraktionen der Größenausschluss-Chromatographie mittels LC-ESI MS/MS: Es wurden jeweils 20 μl der verdauten Fraktionen 1.5A-D in eine 96-Well-PCR-Platte überführt und in den Autosampler des LC-ESI MS/MS gestellt. Der Autosampler injizierte jeweils 8 μl Probe auf ein Chip-System der Firma Agilent. Die Probe wurde auf eine Trapping C18-Säule (40 nl ZORBAX 300SB C18), die sich auf den Chip befand, mit einem Fluss von 4 μl/min 10 Minuten mit 100% Puffer A (3% ACN, 0,1% Ameisensäure) aufgetragen. Als Trennsäule (Analytische Säule), die sich ebenfalls auf dem Chip befand, wurde eine C18-Säule mit einem (C18-Säule 150 mm × 75 μm ZORBAX 300SB) verwendet. Es wurde 45 Minuten ein Gradient von 0% auf 40% B (80% ACN, 0,1% Ameisensäure) gefahren und für 3 Minuten auf 97% B. Anschließend wurde 2 Minuten bei 97% B und dann auf 3% B gespült. Zur Auswertung der generierten ESI-Daten wurde die Software DataAnalysis und Mascot verwendet.

Mit dem Data Analysis Programm von Agilent konnten die generierten MS Spektren automatisch in Aminosäuresequenzen übersetzt werden. Mit Hilfe des Mascot generic file (mgf) konnte eine Mascot-Datenbankabfrage erfolgen. Mit Hilfe der Datenbankabfrage konnte eine Protease, der humane Komplement Faktor I (EC-Nummer: 3.4.21.45) identifiziert werden. Insgesamt konnten 9 Peptide mit folgenden AS-Sequenzen (SEQ ID NO 4-12): VFSLQWGEVK, AQLGDLPWQVAIK, GLETSLAECTFTK, ADSPMDDFFQCVNGK, TMGYQDFADVVCYTQK, YQIWTTVVDWIHPDLK, EANVACLDLGFQQGADTQR, VANYFDWISYHVGRPFISQYNV, DASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLR bei einem signifikanten Score von 392 identifiziert werden. Die Sequenzabdeckung für den Komplement Faktor I betrug 25%. Drei weitere tryptisch verdaute Proben Fraktion 1.5A, 1.5C und 1.5D aus der Größenausschluss-Chromatographie () wurden mittels LC-ESI-MS/MS analysiert. In keiner dieser Proben konnte eine Protease identifiziert werden.

Nach Identifizierung des Komplement Faktor I in der 1.56 Fraktion wurde nach einer kommerziellen Präparation des Komplement Faktor I gesucht. Eine aus humanem Plasma aufgereinigte Präparation wurde von Sigma angeboten. Da für weitere Charakterisierungsversuche diese Präparation als Positivkontrolle eingesetzt werden sollte, musste sichergestellt sein, dass keine weiteren Proteasen, die die Ergebnisse verfälschen könnten, vorhanden sind. Dafür wurde ein Teil der Präparation tryptisch verdaut und mit der LC-ESI-MS/MS identifiziert.

Die Datenbankabfrage ergab, dass mit einem von Score 998 an erster Stelle der humane Komplement Faktor I identifiziert werden konnte. Folgende Peptide wurden identifiziert: FSVSLK, TMFICK, IVIEYVDR, VFCQPWQR, SFPTYCQQK, RIVIEYVDR, VFSLQWGEVK, GLETSLAECTFTK, RAQLGDLPWQVAIK, ADSPMDDFFQCVNGK, TMGYQDFADVVCYTQK, YQIWTTVVDWIHPDLK, RTMGYQDFADVVCYTQK, EANVACLDLGFQQGADTQR, ACDGINDCGDQSDELCCK, IIFHENYNAGTYQNDIALIEMK. Die Sequenzabdeckung für den Komplement Faktor I betrug 34 %. Außer dem Komplement Faktor I konnte in der Präparation noch Albumin identifiziert werden. Da es keinen Hinweis auf eine weitere Protease in der kommerziellen Präparation gab, konnte diese Präparation als Positivkontrolle für Charakterisierungversuche eingesetzt werden.

Vergleich der AS-Sequenzen der tryptischen Peptide der kommerziellen Präparation des humanen Komplement Faktor I und der 1.5 B-Fraktion:
In der tryptisch verdauten Probe der kommerziellen Präparation des Komplement Faktor I konnten 16 Peptide, in der 1.56 Fraktion 10 Peptide dem Komplement Faktor I zugeordnet werden. Insgesamt wurden in beiden Fraktionen 7 Peptide gefunden, die identische AS-Sequenzen besitzen.

Nachweis einer UII-generierenden Aktivität der 1.5 B-Fraktion und des Komplement Faktor I mit dem MES-Assay: Um sicherzustellen, dass der Komplement Faktor I eine UCE-Aktivität besitzt, wurden die 1.5B-Fraktion und die kommerzielle Komplement Faktor I-Präparation mit Hilfe des MES-UCE-Assay auf die UCE-Aktivität untersucht.

7 zeigt die Ergebnisse des Nachweises einer Bestimmung der UCE-Aktivität der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation zum Vergleich mit der gereinigten Fraktion 1.56. Beide Fraktionen zeigen einen Abbau des UCE-S zum UII. Die MALDI-Spektren zeigen auch die Generierung der zwei Zwischenstufen (KR-UII und R-UII) des UII in der gereinigten Fraktion 1.5B und der kommerziellen Präparation des Komplement Faktor I. Die Ergebnisse zeigen, dass der Komplement Factor I eine UCE-Aktivität besitzt. Nachweis einer identischen proteolytischen Aktivität der 1.5B Fraktion und der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation mittels Fluoreszenzassay: Tsiftsoglou et al. konnte zeigen, dass der Komplement Faktor I das Fluoreszenzsubstrat Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC umsetzen kann. Für den Nachweis, dass die 1.5B-Fraktion wie der Komplement Faktor I das Substrat umsetzt, wurde ein Fluoreszenzassay durchgeführt. Die kommerzielle Komplement Faktor I-Präparation diente als Positiv-Kontrolle.

8 zeigt die Ergebnisse des Fluoreszenzassays. Fraktion 1.5B (b) und der Komplement Faktor I der kommerziellen Präparation (c) zeigen eine Umsetzung des Fluoreszenzsubstrates Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC ab einer Inkubationszeit von 4,5h und sie erreicht ein Plateau nach 13h. Der Fluoreszenzassay zeigt, dass in der 1.56-Fraktion als auch in der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation eine proteolytische Aktivität vorhanden ist, die das Fluoreszenz-Substrat Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC umsetzt.

Untersuchung auf N-glykosidisch gebundene Oligosaccharide des Mannose-Typs im Komplement Faktor I a) der kommerziellen Präparation und b) der 1.5B-Fraktion mit Hilfe des GNA-Lektin Glykoprotein Kit:
Es ist bekannt, dass der Komplement Faktor I ein Glykoprotein vom Mannose-Typ ist. Mit Hilfe von Filtrationssäulen mit gekoppelten GNA-Lektin sollte untersucht werden, ob die 1.56-Fraktion sich an diese GNA-Lektin-Säulen binden lässt. Als Vergleich wurde die kommerzielle Komplement Faktor 1-Präparation eingesetzt.

Anhand der MALDI-Spektren A und C (9) konnte eine UCE-Aktivität in den Eluaten der 1.5B-Fraktion und der Komplement Faktor I-Präparation gefunden werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass beide Fraktionen an den GNA-Lektin-Säulen gebunden haben und von ihnen eluiert werden konnten. Beide Fraktionen besitzen wie erwartet, N-glykosidisch gebundene Ologosaccharide mit Mannose-Strukturen. Auch in den Überständen der beiden Fraktionen ist eine UCE-Aktivität wiederzufinden (MALDI-Spektren B und D). Dies könnte auf das Überschreiten der Bindungskapazität der Lektinsäulen zurückzuführen sein, sodass nicht alle Komplement Faktor I-Moleküle binden konnten.

Charakterisierungsversuche der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Komplement Faktor 1-Präparation mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotinin

Es ist bekannt, dass der Komplement Faktor I eine Serinprotease ist. Für die weitere Charakterisierung der 1.5B-Fraktion im Vergleich mit der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation wurden untersucht, ob sich die UII-generierende Aktivität in beiden Fraktionen mit dem Serinprotease-Inhibitor Aprotinin hemmen lassen.

11 zeigt bei Inkubation mit Aprotinin eine vollständige Hemmung der UCE-Aktivität der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation. Es gibt keine UII Signale und keine von möglichen Zwischenprodukten (R-UII und KR-UII) Es konnte jedoch ein Peptid mit der Masse 1801.8 Da (im Spektrum mit X bezeichnet) gefunden werden. Diese Masse entspricht dem KKR-UII Peptid (Tabelle), welches um 6 Aminosäuren vom N-Terminus des UCE-S verkürzt ist. Dafür verantwortlich könnte eine proteolytische Verunreinigung in der kommerziellen Aprotinin-Präparation sein, da das Aprotinin aus der Rinderlunge aufgereinigt wurde und begleitende Proteine enthalten kann.

Charakterisierungsversuche der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Komplement Faktor 1-Präparation mit dem Serinproteaseinhibitor Pefabloc SC

Tsiftsoglou et al. konnte zeigen, das sich der Komplement Faktor I vollständig mit Pefabloc SC (auch als AEBSF bezeichnet) inhibieren ließ. Vorangegangene Inhibitionsversuche (Punkt 3.2.7) haben gezeigt, dass die 1.56-Fraktion nicht vollständig von Pefabloc SC inhibiert werden konnte. Grund dafür könnte die eingesetzte Konzentration des Inhibitors sein. Daraufhin wurde die von Tsiftsoglou et al. angegebene Pefabloc SC-Konzentration für den Inhibitionsversuch eingesetzt.

10 zeigt die Ergebnisse des Inhibitionsversuchs mit Pefabloc Sc. In beiden Fraktionen sowohl in der 1.56-Fraktion als auch der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation konnte nach 24h Inkubation keine UII-generierende Aktivität oder die Entstehung von weiteren UCE-S-Produkten beobachtet werden. Der Inhibitionsversuch hat gezeigt, dass mit einer Konzentration von 2,5 mM Pefabloc SC eine vollständige Hemmung der UCE-Aktivität erreicht werden konnte.

Beispiel 6: UCE-Aktivitätsassay mit humanem Komplement Faktor 1

Nachweis einer UCE-Aktivität der 1.5 B-Fraktion und des Complement Faktor I mittels MES: Es wurden 10 μl einer käuflich erworbenen 1 mg/ml Complement Faktor I-Lösung und 20 μl der 1.58-Fraktion aus der Größenausschluss-Chromatographie an 30 μl Sepharose immobilisiert und die UCE-Aktivität getestet (siehe Beispiel 1). Aliquots der Inkubationsansätze wurden nach 2h, 4h, 7h und 24h abgenommen.

Nachweis einer identischen proteolytischen Aktivität der 1.58 Fraktion aus der Größenausschluss-Chromatographie und des Complement Faktor I mittels Fluoreszenzassay: In eine schwarze 96-Well-Mikrotiter-Platte wurde in Position A1 die Negativ-Kontrolle mit 50 μl 25 mM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC-Fluoreszenzsubstrat aufgenommen in 150 μl Puffer 1 (25 mM Bicine-Puffer, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, pH 8.25) pipettiert. In das Well A2 wurden 50 μl einer 25 μM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC-Substrat-Lösung und 10 μl der Fraktion 1.5B aus der Größenausschluss-Chromatographie aufgenommen in 140 μl Puffer 1 pipettiert. In das Well A3 wurden 50 μl einer 25 μM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC-Substrat-Lösung und 5 μl (entsprach 5 μg) einer kommerziellen Präparation des humanen Complement Faktor I aufgenommen in 145 μl Puffer 1 pipettiert. Die Platte wurde bei 37°C 12h inkubiert und bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm und einer Emissionswellenlämge von 465 nm alle 30 min vermessen. Der Fluoreszenzassay wurde nach der Vorschrift von S. A. Tsiftsoglou und R.B. Sim durchgeführt ("Human complement factor I does not require cofactors for cleavage of synthetic substrates." J Immunol 173(1): 367–75)

Versuche zur Glykoproteincharakterisierung der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Complement Faktor 1-Präparation: Für die Durchführung der Charakterisierung wurden ein Mannose Glykoprotein Kit mit gekoppelten GNA-Lektin und ein O-Glykan Glykoprotein Kit mit gekoppelten PNA-Lektin der Firma Qiagen verwendet. Die Vorgehensweise erfolgte nach Vorschrift von Qiagen. Alle Puffer und Lösungen waren in dem Kit enthalten. Zu Beginn wurden die Fraktionssäulen in 2 ml Eppendorfgefäße platziert und anschließend 500 μl des jeweiligen Bindungspuffers zugegeben und 2 min bei 500 rpm zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Für die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurden adäquate Proteinmengen der Fraktion 1.58 und der kommerziellen Präparation des Complement Faktor I eingesetzt. Von der Fraktion 1.5B wurden 2 × 30 μl (0,1 mg/ml) in jeweils 500 μl des entsprechenden Bindungspuffers aufgenommen. Von der kommerziellen Präparation des Complement Faktor I wurden jeweils 2 × 3 μl (1 mg/ml) abgenommen und mit Wasser auf 30 μl aufgefüllt und anschließend mit 500 μl des entsprechenden Bindungspuffers vermischt. Die in Puffer aufgenommen Proben wurden zu den entsprechenden Fraktionssäulen pipettiert und 2 min bei 500 rpm zentrifugiert. 100 μl des Durchfluss wurden an 50 μl Sepharosebeads immobilisiert und der Rest verworfen. Die Lektinsäulen wurden 3mal mit dem jeweiligen Bindungspuffer gewaschen, für 2 min bei 500 rpm zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Für die Elution der Proteine von den Lektinsäulen wurden 300 μl Elutionspuffer zu den Lektinsäulen pipettiert und 1 min inkubiert. Anschließend wurde 5 min bei 500 rpm zentrifugiert und 100 μl des Eluats an 50 μl Sepharosebeads immobilisiert. Die Abnahmen der Aliquots der Überstände erfolgte nach 1,5h; 3,5h; 5,5h und 24h und die Abnahmen der Eluate nach 1,5h; 3,5h und 24h. Die Proben wurden dann massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel 1).

Charakterisierungsversuche der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Complement Faktor 1-Präparation mit den Serinproteaseinhibitoren Aprotinin und Pefabloc SC: Für die Charakterisierungsversuche wurden 4 × 30 μl Sepharosebeads vorbereitet. Jeweils 2 × 30 ul einer 0,1 mg/ml 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Complement Faktor I-Präparation wurden an Sephaosebeads immobilisiert. Für die Inkubation wurden jeweils die 27 μl einer 10–5M UCE-S-Lösung mit jeweils 3 μl einer 10 μM Aprotinin-Lösung und 2,5 mM einer Pefabloc SC-Lösung vermischt und zu den jeweiligen immobilisierten Proteinen gegeben. Die Abnahmen der Aliquots erfolgte nach 1,5h; 3,5h; 5,5h und 24h. Anschließend wurden die abgenommenen Aliquots massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel 1).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.