Title:
Programmierbare Oligonukleotidsynthese
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren.




Inventors:
Stähler, Peer (Mannheim, 68167, DE)
Carapito, Raphael, Dr. (Strasbourg, FR)
Application Number:
DE102006039479
Publication Date:
03/06/2008
Filing Date:
08/23/2006
Assignee:
febit biotech GmbH (Heidelberg, 69120, DE)



Attorney, Agent or Firm:
Weickmann & Weickmann (München, 81679)
Claims:
1. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren, insbesondere von Nukleinsäuredoppelsträngen, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäurefragmenten durch Festphasensynthese, vorzugsweise an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen festen Trägers, und
(b) Zusammenfügen von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus (a) durch Bindung aneinander,
wobei mindestens einige Nukleinsäurefragmente, die einen hohen AT-Gehalt aufweisen, in einer gegenüber anderen Fragmenten gesteigerten Menge für Schritt (b) eingesetzt werden.

2. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren, insbesondere von Nukleinsäuredoppelsträngen, umfassend die Schritte:
(a) Herstellen einer Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäurefragmenten durch Festphasensynthese, vorzugsweise an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen festen Trägers, und
(b) Zusammenfügen von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus (a) durch Bindung aneinander,
wobei das Verfahren Amplifikationsschritte umfasst, bei denen die synthetisierten Nukleinsäurefragmente oder/und daraus gebildete, gegebenenfalls doppelsträngige Zwischenprodukte einer Amplifikation, z.B. einer PCR, unterzogen werden.

Description:

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren.

Einleitung

Der Bedarf an synthetischen Nukleinsäuren ist durch die Molekularbiologie und die biomedizinische Forschung und Entwicklung hoch. Die Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren (DNA, RNA oder deren Analoga) wird überwiegend mit Hilfe von säulengestützten Synthesizern durchgeführt.

Besonders wichtige und weit verbreitete Einsatzgebiete für synthetische Nukleinsäurepolymere sind Primer für die Polymerase chain reaction (PCR) (Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 26 (3/4), 301-334, 1991) und die Sequenziermethode nach Sanger (Proc. Nat. Acad. Sci. 74, 5463-5467, 1977).

Synthetische DNA spielt auch für die Herstellung von synthetischen Genen eine Rolle. Beschrieben werden Methoden der Gensythese als Beispiel in US 6 586 211 B1, in PCT/EP2004/013131, in WO 00/13017 A2, in S. Rayner et al., PCR Methods and Applications 8 (7), 741-747, 1998, in WO 90/00626 A1, in EP 385 410 A2, in WO 94/12632 A1, in WO 95/17413 A1, in EP 316 018 A2, in EP 022 242 A2, in L. E. Sindelar and J. M. Jaklevic, Nucl. Acids Res. 23 (6), 982-987, 1995, in D. A. Lashkari, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92 (17), 7912-7915, 1995, und in WO 99/14318 A1, die als Referenz eingeschlossen werden.

Zwei weitere Anwendungsfelder mit steigendem Bedarf sind die Herstellung von Mikroarrays oder Biochips aus Oligonukleotid-Sonden (1. Nature Genetics, Vol. 21, Supplement (gesamt), Jan. 1999, 2. Nature Biotechnology, Vol. 16, 981-983, Okt. 1998, 3. Trends in Biotechnology, Vol. 16, 301-306, Jul. 19989) und die Herstellung von interferierender RNA (iRNA oder RNAi) für die Modulation der Genexpression in Zielzellen (PCT/EP01/13968).

Die genannten Anwendungsgebiete der Molekularbiologie liefern wertvolle Beiträge in der Wirkstoff-Entwicklung, der Wirkstoff-Produktion, der kombinatorischen Biosynthese (Antikörper, Effektoren wie Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter etc.), in der Biotechnologie (z.B. Enzymdesign, Pharming, biologische Herstellungsverfahren, Bioreaktoren etc.), in der molekularen Medizin im Tissue Engineering, in der Entwicklung und Anwendung neuer Materialien (z.B. Werkstoffe wie Spinnenseide und Perlmutt), in der Entwicklung und Anwendung von Diagnostika (Mikroarrays, Rezeptoren und Antikörper, Enzymdesign etc.) oder in der Umwelttechnik (spezialisierte oder maßgeschneiderte Mikroorganismen, Produktionsverfahren, Sanierung, Sensoren etc.). Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann somit in allen diesen Bereichen erfolgen.

Stand der Technik

Die am weitesten verbreitete Methode zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren basiert auf Grundlagenarbeiten von Caruthers und wird als Phosphitamid-Methode beschrieben (M. H. Caruthers, Methods in Enzymology 154, 287-313, 1987). Die Sequenz der entstehenden Moleküle kann dabei durch die Syntheseabfolge gesteuert werden. Andere Verfahren, wie z.B. die H-Phosphonat-Methode, dienen dem gleichen Zweck des sukzessiven Aufbaues eines Polymers aus seinen Untereinheiten, haben sich aber nicht so weit durchsetzen können wie die Methode nach Caruthers.

Um das chemische Verfahren der Polymersynthese aus Untereinheiten automatisieren zu können, werden meistens feste Phasen verwendet, an denen die wachsende Molekülkette verankert ist. Sie wird erst nach Fertigstellung der Synthese abgespalten, wozu ein geeigneter Linker zwischen dem eigentlichen Polymer und der festen Phase erforderlich ist. Die Methode verwendet zur Automatisierung in der Regel feste Phasen in Form aktivierter Partikel, die in eine Säule gefüllt werden, z.B. controled Pore glass (CPG). Solche festen Phasen tragen in der Regel nur eine definiert entnehmbare Art von Oligo mit einer programmierten Sequenz. Die Zugabe der einzelnen Synthesereagenzien erfolgt nun in einer steuerbaren Art und Weise in einem Automaten, der vor allem die automatisierte Zugabe der einzelnen Reagenzien zur festen Phase sicherstellt. Die Menge an synthetisierten Molekülen ist durch die Menge des Trägermaterials und die Größe der Reaktionsansätze steuerbar. Diese Mengen sind für die oben genannten molekular-biologischen Verfahren entweder ausreichend oder sogar zu hoch (z.B. bei PCR-Primern). Eine gewisse Parallelisierung zur Erzeugung einer Vielzahl unterschiedlicher Sequenzen wird durch Anordnung von mehreren Säulen in einem apparativen Aufbau erreicht. So sind dem Fachmann Geräte mit 96 parallelen Säulen bekannt.

Eine Variante und Weiterentwicklung für die Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren ist die in situ Synthese von Mikroarrays (Array-Anordnung der Nukleinsäuren in einer Matrix). Diese wird auf einem Substrat durchgeführt, das durch die Synthese mit einer Vielzahl unterschiedlicher Sequenzen beladen wird. Der große Vorteil der in situ Syntheseverfahren für Mikroarrays ist die Bereitstellung einer Vielzahl von Oligomeren unterschiedlicher und definierter Sequenz an adressierbaren Lokationen auf einem gemeinsamen Träger. Die Synthese greift dabei auf ein überschaubares Set aus Einsatzstoffen zurück (bei DNA-Mikroarrays in der Regel die 4 Basen A, G, T und C) und baut aus diesen beliebige Sequenzen der Nukleinsäurepolymere auf.

Die Abgrenzung der einzelnen Molekülspezies kann zum einen durch getrennte fluidische Kompartimente bei der Zugabe der Syntheseeinsatzstoffe erfolgen, wie es z.B. in der so genannten in situ Spotting Methode oder Piezoelektrischen Techniken der Fall ist, die auf der Tintenstrahldrucktechnik beruht (A. Blanchard, in Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 20, Ed. J. Sedlow, 111-124, Plenum Press; A. P. Blanchard, R. J. Kaiser, L. E. Hood, High-Density Oligonucleotide Arrays, Biosens. & Bioelectronics 11, 687, 1996).

Eine alternative Methode ist die ortsaufgelöste Aktivierung von Syntheseplätzen, was durch selektive Belichtung, durch selektive oder ortsaufgelöste Generierung Aktivierungsreagenzien (Entschützungsreagenzien) oder durch selektive Zugabe von Aktivierungsreagenzien (Entschützungsreagenzien) möglich ist. Beispiele für die bisher bekannten Verfahren für die in situ Synthese von Mikroarrays sind

  • – die photolithographische lichtgestützte Synthese (McGall, G. et al; J. Amer. Chem. Soc. 119; 5081-5090; 1997),
  • – die projektorbasierte lichtgestützte Synthese (PCT/EP99/06317), die fluidische Synthese mittels Trennung der Reaktionsräume (z.B. Arbeiten von Prof. E. Southern),
  • – die indirekte projektorbasierte lichtgesteuerte Synthese mittels lichtaktivierter Photosäuren und geeigneten Reaktionskammern in einem Reaktionsträger,
  • – die elektronisch induzierte Synthese mittels ortsaufgelöster Entschützung an einzelnen Elektroden auf dem Träger unter Nutzung einer durch die Elektroden induzierten Entstehung von Protonen und
  • – die fluidische Synthese mittels ortsaufgelöster Deposition der aktivierten Synthese-Monomere.

Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren, insbesondere Nukleinsäuredoppelsträngen an einem gemeinsamen festen Träger sind aus WO 00/49142 und WO 2005/051970 bekannt.

Gegenstand der Erfindung

Bereitgestellt werden soll ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren wahlfreier Sequenz, insbesondere Nukleinsäuredoppelsträngen, durch Herstellung geeigneter festphasengestützter synthetischer Bibliotheken, auch als Libraries bezeichnet, und die anschließende Zusammenfügung von mindestens zwei Nukleinsäurefragmenten aus der Bibliothek durch eine Bindung dieser zwei Nukleinsäurefragmente aneinander, wobei die Herstellung der Bibliothek eine Steuerung der Mengenverhältnisse der Bestandteile der Bibliothek zueinander umfasst.

Die Zusammenfügung der Nukleinsäurefragmente erfolgt vorzugsweise durch eine spezifische Hybridisierungsreaktion zwischen Überlappungsbereichen zueinander komplementärer Abschnitte der Nukleinsäurefragmente, wobei längere synthetische doppelsträngige Nukleinsäuren erhalten werden. Die einzelnen, zum Aufbau längerer Nukleinsäuren verwendeten Sequenzabschnitte haben vorzugsweise eine Länge von 20-100 Nukleotidbausteinen, bevorzugt von 25-50 Nukleotidbausteinen, beispielsweise etwa 30 Nukleotidbausteinen. Die Sequenzabschnitte werden dabei vorzugsweise so gewählt, dass sie mit einem Sequenzabschnitt des Gegenstrangs der zu synthetisierenden komplementären Nukleinsäure zumindest teilweise überlappen, so dass der zu synthetisierende Nukleinsäurestrang durch Hybridisierung einzelner Sequenzabschnitte aufgebaut werden kann. Die Länge der Komplementärbereiche bzw. Überlappungen zwischen einzelnen Fragmenten beträgt z.B. 10-50 Nukleotidbausteine, vorzugsweise 12-25 Nukleotidbausteine und besonders bevorzugt etwa 15 Nukleotidbausteine. Wenn der Überlappungs- bzw. Komplementaritätsbereich zwischen zwei Nukleinsäurefragmenten einen hohen AT-Gehalt, z.B. einen AT-Gehalt > 50 %, vorzugsweise einen AT-Gehalt > 60 %, besonders bevorzugt einen AT-Gehalt > 65 % aufweist, ist die Hybridisierung zwischen diesen Fragmenten vergleichsweise wenig effektiv. Dies kann zu einer Verringerung der Ausbeute von Nukleinsäuredoppelsträngen mit der korrekten Sequenz führen.

Durch Steuerung der Mengenverhältnisse einzelner Nukleinsäurefragmente, insbesondere durch Verwendung höherer Mengen von Nukleinsäurefragmenten, die einen hohen AT-Anteil aufweisen, kann die Ausbeute an korrekten Hybridisierungsprodukten und somit auch die Ausbeute an korrekten Nukleinsäuredoppelsträngen verbessert werden. Dabei kann die Menge der Population der entsprechenden Nukleinsäurefragmente um vorzugsweise ≥ 10 %, besonders bevorzugt ≥ 50 % oder noch mehr, z.B. bis um den Faktor 100 oder 1000 mehr gegenüber anderen Nukleinsäurefragmenten ohne hohen AT-Anteil gesteigert werden.

Die Reaktionsprodukte einer Bibliothekssynthese zeichnen sich durch große Vielfalt der Sequenzen aus, die während des Synthesevorgangs frei wählbar programmiert werden können. Ein Zahlenbeispiel illustriert die Vielfalt einer solchen Bibliothek. Ein Mikroarray aus dem Geniom®-System, bei dem die Nukleinsäure-Molekülpopulationen auf einzelnen Syntheseplätzen in einem speziellen mikrofluidischen Träger synthetisiert werden, kann zum Beispiel mit Stand 2006 bis zu 60.000 frei wählbare Oligonukleotide mit einer Sequenz von bis zu 60 Nukleotiden synthetisieren. Die Geräte synthetisieren die Nukleinsäuren ortsaufgelöst unter Nutzung eines projektorbasierten Verfahrens (siehe z.B. WO 00/13018 oder WO 00/13017).

Zweck des verbesserten Verfahrens ist die Bereitstellung von Nukleinsäuren mit hoher und rationell programmierbarer Diversität der Sequenzen und steuerbaren Mengenverhältnissen der einzelnen Sequenz-Vertreter (Bestandteile der Bibliothek) für in einem nächsten Schritt nachfolgende Verfahren.

Beispiele für nachfolgende Verfahren, für die die Erfindung verwendet werden kann, sind:

  • – die Herstellung von Nukleinsäurefragmenten als Primer für Primer Extension Methoden, Strand Displacment Amplifikation, Polymerase Chain Reaction, Site Directed Mutagenesis oder Rolling Circle Amplifikation,
  • – Herstellung von synthetischen Genen, Genfragmenten, Gen-Clustern, Chromosomen, Genomen, optimieren Genomen, minimalen Genclustern, minimalen Genomen, vollsynthetischen Genomen oder von Mischungen mit gezielten oder randomisierten Varianten von synthetischen Genen, Genfragmenten, Gen-Clustern, Chromosomen, Genomen, optimieren Genomen, minimalen Genclustern, minimalen Genomen, vollsynthetischen Genomen
  • – Genexpressions-Modulation mittels RNAi oder Antisense-Methoden, wobei noch eine Abschrift von der erzeugten Nukleinsäure oder den Nukleinsäuren durch eine RNA Polymerase vorgesehen sein kann,
  • – Herstellung oder Vorbereitung von Analyten (sample preparation) für die logisch nachgeordnete Analyse durch Mikroarrays, Sequenzierverfahren, Amplifikationsverfahren (Strand Displacment Amplifikation, Polymerase Chain Reaction oder Rolling Circle Amplifikation) oder Analyse in einer Gelelektrophorese,
  • – RNA-Bibliotheken für die Translation in vitro oder in vivo,
  • – Klonierung der erzeugten Nukleinsäuren alleine oder in Kombination mit weiteren Sequenzen mittels Vektoren oder Plasmiden,
  • – Herstellung von Minimalgenomen, optimierten Genomen, reduzierten Genomen, gemischten Genomen verschiedener Spezies, wobei der gesamte geplante Bestand des Genomes oder ein Teil davon durch die synthetischen Nukleinsäuren kodiert werden kann,
  • – Ligation der Nukleinsäuren in Vektoren, YACs, BACs, Chromosomen oder Plasmide,
  • – Validierung oder Test von Hybridisierungs-Assays und zugehörigen Reagenzien und Kits mittels der erzeugten Nukleinsäurepolymeren in den Bereichen Mikroarrays, Biochips, Dot blots, Southern- oder Northern-Blots, Bead-Arrays, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), PCR, real time PCR,
  • – Referenz- oder Kalibrier-Verfahren oder Verfahrensschritte innerhalb von Assays aus den Bereichen Mikroarrays, Dot blots, Southern- oder Northern-Blots, Bead-Arrays, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), PCR, real time PCR,
  • – Herstellung von bindenden Agenzien wie Aptameren und Ribozymen sowie indirekte Herstellung über die Translation in vivo oder in vitro von Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antikörperfragmenten, Antikörper analog wirkenden Peptiden, Antikörper-analog wirkenden Proteinen,
  • – Herstellung über die Translation in vivo oder in vitro von Glykoproteinen, Proteoglykanen oder Komplexen mit wahlweise Peptid-Anteil, Protein-Anteil, RNA-Anteil oder DNA-Anteil, wie Ribosomen oder Proteasomen.

Ausführliche Beschreibung von Erfindung und Ausführungsformen

Bevorzugte Verfahren zur Herstellung von synthetischen Nukleinsäuren aus einem festen Träger sind aus WO 00/49142 und WO 2005/051970 bekannt. Auf den Inhalt dieser Dokumente wird ausdrücklich Bezug genommen.

Vorzugsweise erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren die Herstellung der synthetischen Nukleinsäuren dadurch, dass eine Vielzahl von unterschiedlicher Nukleinsäurefragmente an verschiedenen Positionen eines gemeinsamen, festen Trägers synthetisiert wird. Vorzugsweise umfasst die Synthese der Nukleinsäurefragmente einen Aufbau aus Nukleotidbausteinen mittels nass- und/oder fotochemischer Verfahren auf dem Träger, anschließendes Ablösen der Nukleinsäurefragmente und Assemblieren der Fragmente zu dem gewünschten Nukleinsäuredoppelstrang. Weiterhin kann die Synthese Amplifikationsschritte umfassen, bei denen die synthetisierten Nukleinsäurefragmente oder/und daraus gebildete, gegebenenfalls doppelsträngige Zwischenprodukte einer Amplifikation, z.B. einer PCR, unterzogen werden. Hierzu können Nukleotidbausteine und ein Enzym, das eine Amplifikation bewirkt, zugeführt werden. Amplifikationen können auf dem Träger, d.h. vor oder/und nach Ablösung der Nukleinsäurefragmente, oder/und nach Flution vom Träger erfolgen.

Der Träger kann ausgewählt werden aus flachen Trägern, porösen Trägern, Reaktionsträgern mit Elektroden, Reaktionsträgern mit Partikeln oder Beads, mikrofluidischen Reaktionsträgern, die gegebenenfalls Oberflächenmodifikationen wie Gele, Linker, Spacer, Polymere, amorphe Schichten oder/und 3D-Matrices aufweisen, und Kombinationen der zuvor genannten Träger. Vorzugsweise ist der Träger ein mikrofluidischer Träger.

Die Nukleinsäurefragmente werden vorzugsweise durch Orts- oder/und zeitaufgelöste in situ Synthese auf dem Träger erzeugt, beispielsweise durch Orts- oder/und zeitaufgelöste Belichtung mittels einer programmierbaren Lichtquellenmatrix. Die ort- oder/und zeitaufgelöste Synthese kann in einem mikrofluidischen Träger mit einem oder mehreren fluidischen Reaktionsräumen und einem oder mehreren Reaktionsbereichen innerhalb eines fluidischen Reaktionsraums erfolgen.

Unterschiedliche Mengen von für die Assemblierung verwendeten Nukleinsäurefragmentspezies können durch Verwendung von mehreren Bereichen und/oder größeren Bereichen für die Synthese der jeweiligen Nukleinsäurefragmente auf dem Träger erzeugt werden. Ein entsprechend modifizierter Träger ist auch Gegenstand der Erfindung.

Ein weiterer – gegebenenfalls unabhängiger – Gegenstand der Erfindung besteht darin, die Assemblierung von Nukleinsäurefragmenten zu Nukleinsäuredoppelsträngen in mehreren Schritten durchzuführen. In einem ersten Schritt werden dabei die auf dem Träger synthetisierten Nukleinsäurefragmente am 5'- oder/und 3'-Ende mit einer oder mehreren generischen Primersequenzen von vorzugsweise 10-20 Basen, besonders bevorzugt etwa 15 Basen versehen, wobei die Primersequenzen so gewählt sind, dass eine Amplifikation nach Hybridisierung von zwei Nukleinsäurefragmenten mit teilweisen komplementärer Sequenz möglich ist. Nach Abspalten der mit Primern versehenen Nukleinsäurefragmente vom Träger und gegebenenfalls nach Flution aus dem Träger erfolgt eine Hybridisierung von Fragmentpaaren mit komplementärer Sequenz und eine anschließende Amplifikation, z.B. durch PCR, durch Zugabe entsprechender Primer. In der Amplifikationsreaktion entstehen Nukleinsäurefragmente, die an ihren Enden die generische Primersequenz enthalten. Nach Abspaltung der Primersequenz, z.B. mittels Restriktionsendonukleasen, können die resultierenden Nukleinsäurefragmente weiteren Amplifikationszyklen unterzogen werden, um einen Nukleinsäuredoppelstrang zu erzeugen.

Der durch Synthese von Fragmenten und deren anschließende Assemblierung erzeugte Nukleinsäuredoppelstrang wird vorzugsweise in einen Vektor, z.B. in ein Plasmid, eingebaut und in eine geeignete Wirtszelle, z.B. eine Bakterienzelle, überführt.

Die Herstellung der Nukleinsäurepolymere bietet an mehreren Stellen des Verfahrens die Möglichkeit, mit bekannten Methoden in die Reaktionsprodukte Modifikationen oder Markierungen einzuführen. Hierzu zählen markierte Nukleotide, die z.B. mit Haptenen oder optischen Markern, wie Fluorophoren und Lumineszenz-Markern, modifiziert sind, markierte Primer oder Nukleinsäure-Analoga mit besonderen Eigenschaften, wie z.B. besondere Schmelztemperatur oder Zugänglichkeit für Enzyme.

Im Folgenden ist eine beispielhafte Ausführungsform der Erfindung und Ablauf des Verfahrens unter Nutzung der GENIOM®-Plattform dargestellt:

  • 1. Design eines Mikroarrays aus 6.000 verschiedenen 30meren in einem GENIOM®-Gerät. Bei dem Design des Mikroarrays wird die Anzahl der Synthesespots pro Sequenz zwischen 1 und 100 (in einfachen Schritten) gewählt, wobei Nukleinsäurefragmente (Oligos) mit geprüfter oder vorhergesagter schwächerer Bindung relativ zu anderen Sequenzen, die später an einer Zusammenlagerung teilnehmen, mit einer um vorzugsweise 50 % oder mehr größeren Anzahl an Synthesespots vertreten sind, als mindestens eine andere Oligo-Sequenz, um den prozentualen Anteil im Gemisch zu erhöhen und so die entsprechenden Hybride gegenüber den stärker bindenden anderen Sequenzen zu fördern.
  • 2. Anfügen einer generischen Primer-Sequenz von 15 Basen an allen 6.000 Oligos. Die Primer-Sequenz ist so gewählt, dass eine PCR Reaktion durch Hybridisierung von jeweils zwei Oligos mit komplementärer Sequenz möglich ist.
  • 3. Herstellen des Mikroarrays anhand des Designs im GENIOM®-Gerät.
  • 4. Abspalten und Flution der Oligos aus dem Reaktionsträger.
  • 5. PCR der Zweierkombinationen der Library unter Zugabe eines zu den unter 2 angefügten Primer Sequenzen passenden Primer Paares. In der PCR entstehen 60mere.
  • 6. Abspalten der 15-Basen Primer Sequenz.
  • 7. Inkubation der resultierenden 30mer Library mit neuen PCR Reagenzien unter Zugabe eines Primer Paares, dass zu einer „nested PCR" eines längeren Fragmentes führt (eine direkte Zusammenlagerung und PCR Amplifikation eines synthetischen Genes ist dem Fachmann durch Publikationen bekannt).
  • 8. Weitere Bearbeitung oder Lagerung des resultierenden Vervielfältigungsproduktes (Amplikon). Vorzugsweise wird das Amplikon unter Nutzung eines Plasmides in Bakterien kloniert und nach Anwachsen von Klonen eine Anzahl von 10 Inserts in den Klonen sequenziert. Das sequenzgeprüfte synthetische Gen steht zur Verfügung.

Im Stand der Technik ist bekannt, dass die Nutzung von unterschiedlichen Mengenverhältnissen der einzelnen Oligonukleotide zueinander für eine Zusammenlagerung von synthetischen Genen die Rate an korrekten Sequenzen erhöht (Gao, X et al., Nucleic Acids Research, 2003, Vol 31; No.22; P:143). Die Stöchiometrie der Oligonukleotide hat einen Einfluss auf die thermodynamischen Parameter und wirkt sich durch das Massenwirkungsgesetz aus.

In der bevorzugten Ausführungsform und in einer Reihe der eingangs beschriebenen Herstellverfahren für die Herstellung von Mikroarrays in situ kann das Design, d.h. die konkrete Beladung und Zuweisung von Fläche und Lokation auf dem Reaktionsträger für eine einzelne Oligonukleotid-Spezies, flexibel gewählt werden und somit auch die Menge der einzelnen Oligonukleotide. Diese Menge ist entsprechend nach Ablösen und Flution der Oligos auch in dem Pool an diversen Oligo-Spezies in Lösung steuerbar. Bei Verwendung von Projektionstechnologie für die Synthese auf dem Reaktionsträger kann die Mengenverteilung über die Anzahl der Mikrospiegel oder Projektionselemente (Belichtungspixel) eingestellt werden. Dem Fachmann ist aus diesem Beispiel ersichtlich, dass auch bei anderen Verfahren in Analogie das Design die Mengen bestimmt. So wird zum Beispiel bei einem photolithographischen Verfahren über die Fläche der Syntheseplätze die Menge bestimmt, bei einer indirekten, über Photosäuren arbeitenden Methode über die Anzahl an physisch abgetrennten Reaktionsplätzen, die für eine Sequenz verwendet werden.

Die Einstellung und Steuerung der Mengenverhältnisse kann durch einen Anwender oder durch eine Software erfolgen. Durch eine entsprechende Software können Vorgaben für die Einstellung der Mengenverhältnisse programmiert werden. Dadurch kann der Prozess an bestimmten Stellen automatisiert werden. Die Vorgaben können aus theoretischen Modellen, Bioinformatik, Sequenz-Vergleichen, empirischen Daten oder Informationen in Datenbanken abgeleitet sein.

Für die empirische Bestimmung und für die Ermittlung der optimalen Anzahl an Syntheseeinheiten pro Sequenz, in einer bevorzugten Ausführungsform an Mikrospiegeln in einer Projektionseinheit, kann eine Hybridisierungsreaktion auf einem Mikroarray verwendet werden. Dazu werden die in Lösung befindlichen ausgewählten Oligos auf einen Mikroarray hybridisiert, der solche Sequenzen enthält, wie sie für die Zusammenlagerung als jeweils komplementäre Gegenparts auf den jeweils korrespondierenden Oligos vorgesehen sind. Diese Analyse simuliert die Zusammenlagerungsreaktion. Das Ergebnis kann in einer Ausführungsform durch Fluoreszenzmarker, die direkt oder indirekt an den in Lösung befindlichen Oligos befestigt sind, ermittelt werden. Die Signale von einzelnen Analyse-Spots kann man dann relativ zueinander auswerten oder quantifizieren. Als Ergebnis dieser Analyse kann das Mengenverhältnis durch Veränderung des Synthese-Design angepasst werden.

Die Anpassung der Mengenverhältnisse verbessert die Bindungsbedingungen für Oligos mit erhöhter Menge in dem Gemisch, und inhärent vergleichsweise niedrigere Bindungsstärken werden ausgeglichen. Die Wahrscheinlichkeit für die korrekte Einlagerung in das Gesamtensemble von Oligos, die an der Reaktion teilnehmen, wird für alle Oligos equilibriert.

Eine vergleichsweise niedrigere Bindungsstärke eines Oligos mit einer passenden Sequenz auf einem zweiten Oligo kann neben weiteren Parametern durch die Rasenzusammensetzung, vor allem den AT-Anteil (wenn nur natürliche Basen verwendet werden), durch die Neigung zu Sekundärstrukturen oder durch weitere Interaktionen mit anderen Oligos in dem Gemisch verursacht sein.

In einer Ausführungsform ist die Vervielfältigung der abgelösten Oligonukleotide Bestandteil des Verfahrens.

Die Oligonukleotide oder ein Teil davon können mit generischen 5'- und/oder 3'-Sequenzen, angefügt an die Sequenz der herzustellenden Nukleinsäure, synthetisiert werden, so dass anschließend eine Amplifikation der Oligonukleotide oder eines Teils davon erfolgen kann. Die Amplifikations- bzw. Primersequenzen sind komplementär zu entsprechenden Amplifikationsprimern und können eine oder mehrere Spaltungsstellen, vorzugsweise TypII-Spaltungsstellen, enthalten. Diese Spaltungsstellen ermöglichen eine Abspaltung der Primersequenzen nach der Amplifikation, z.B. durch PCR. Auf einem Träger können mehrere Paare von Amplifikationsprimersequenzen verwendet werden, um eine Multiplex-Amplifikation, z.B. PCR, in einer Oligonukleotidbibliothek zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass Subpopulationen der Oligonukleotidfragmente spezifische, aber unterschiedliche Amplifikationssequenzen oder Paare von Amplifikationssequenzen enthalten können. Die Amplikons können aufgereinigt oder direkt für die Amplifikationsreaktion, z.B. für die PCR, eingesetzt werden.

In dieser Ausführungsform kann das Verfahren zur selektiven Amplifikation einer Subpopulation der von Träger stammenden Sequenzen verwendet werden. Dabei wird auch die Vervollständigung von Nukleinsäurefragmenten ermöglicht, die nach der Synthese nicht in Volllängenform waren. Die Amplifikationen können direkt in den Mikrokanälen des Trägers oder/und vom Träger in einem geeigneten Reaktionsgefäß erfolgen. Auf diese Weise kann die Menge der für die Gensynthese verfügbaren Nukleinsäurefragmente signifikant erhöht werden. Weiterhin werden die während der Synthese entstandenen verkürzten Fragmente, welche die Assemblierungsreaktion hemmen können, verdünnt und liegen im Vergleich zu den amplifizierten Volllängenfragmenten in vernachlässigbaren Konzentrationen vor.

In noch einer weiteren – gegebenenfalls unabhängigen – Ausführungsform kann eine Isolierung von Nukleinsäurefragmenten mit der gewünschten korrekten Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäuren erfolgen. Hierzu können beispielsweise bekannte Techniken, wie emulsionsbasierte PCR oder Einzelmolekülarrays, verwendet werden, bei denen klonale Molekülpopulationen oder Einzelmoleküle aus einem Gemisch von DNA-Fragmenten isoliert und sequenziert werden können. Durch Anwendung derartiger Verfahren während des Gensyntheseverfahrens kann das assemblierte Gen „monoklonalisiert" und jedes der einzelnen Fragmente separat sequenziert werden. Nach Sequenzverifikation kann das Fragment mit der gewünschten Sequenz identifiziert, isoliert und weiter prozessiert werden, z.B. durch Klonierung, DNA-basierende Assays, in vitro Proteinexpression etc. Das Gemisch von DNA-Fragmenten kann ein PCR-Produkt, ein Ligationsprodukt oder eine Oligonukleotidbibliothek sein.

Eine – gegebenenfalls unabhängige – weitere Ausführungsformen der Erfindung betrifft die Erzeugung von Bibliotheken, die eine Vielzahl von Varianten eines Gens enthalten, durch Synthese multipler Varianten von einem oder mehreren der Nukleinsäurefragmente auf dem Träger vor der Genassemblierung.

Noch eine weitere – gegebenenfalls unabhängige – Ausführungsform der Erfindung betrifft die enzymatische Abspaltung der Nukleinsäurefragmente vom Träger.

Noch eine weitere – gegebenenfalls unabhängige – Ausführungsform der Erfindung betrifft die Aufreinigung einer Bibliothek von Nukleinsäurefragmenten durch Rehybridisierung auf einem Träger, welcher die komplementären Sequenzen enthält.

Noch eine weitere – gegebenenfalls unabhängige – Ausführungsform der Erfindung betrifft die Anfügung primerspezifischer DNA-Sequenzen an die Nukleinsäurefragmente, welche das 5'-Ende und das 3'-Ende des zu synthetisierenden Nukleinsäuredoppelstrangs bilden. Auf diese Weise können mehrere aufeinanderfolgende Reaktionen mit dem gleichen Primerpaar durchgeführt werden. Außerdem können unterschiedliche Gene aus unterschiedlichen Trägern gleichzeitig mit denselben Primern amplifiziert werden, wodurch das Verfahren automatisiert wird.

Noch eine weitere – gegebenenfalls unabhängige – Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erzeugung synthetischer Targetnukleinsäuren für Standard-Mikroarrayanalyseverfahren, z.B. von Sonden, die auf Standard-Mikroarrays immobilisiert werden.

Die zuvor genannten Ausführungsformen können selbstverständlich miteinander kombiniert werden.

Generell können alle Reaktionsträger und festen Phasen für das erfindungsgemäße Verfahren genutzt werden, für die eine Synthese einer Matrix aus Nukleinsäurepolymeren möglich ist.

Dazu gehören als beispielhafte Vertreter die folgenden, dem Fachmann bekannten Reaktionsträger-Formate und festen Phasen:

  • – Flacher Reaktionsträger, auch „Chip" genannt,
  • – Poröser Träger,
  • – Reaktionsträger mit Elektroden,
  • – Reaktionsträger mit temporär oder permanent immobilisierter fester Phase aus Partikeln oder Beads,
  • – Mikrofluidischer Reaktionsträger,
  • – Oberflächen-Modifikation: Gele, Linker, Spacer, Polymere, amorphe Schichten, 3D-Matrizes.

Einige dieser Reaktionsträger können in Kombination verwendet werden, z.B. ein mikrofluidischer Reaktionsträger mit porösen Oberflächen.

Der Aufbau der DNA-Sonden findet vorzugsweise durch lichtgesteuerte in situ Synthese auf einem mikrofluidischen Träger, z.B. in einem GENIOM® one instrument (febit biotech GmbH) unter Verwendung geeigneter Schutzgruppenchemie in einer dreidimensionalen Mikrostruktur statt. In einem zyklischen Syntheseprozess wechseln sich Belichtungen und Kondensationen der Nukleotide so lange ab, bis an jeder Position des Arrays in den Mikrokanälen die gewünschte DNA-Sequenz vollständig aufgebaut wurde. Auf diese Weise können z.B. bis zu 48.000 Oligonukleotide mit einer Länge von z.B. bis zu 60 Einzelbausteinen hergestellt werden. Die Oligonukleotide können dabei kovalent an ein Spacermolekül, einen chemischen Abstandhalter auf der Glasoberfläche des Reaktionsträgers binden. Die Synthese verläuft softwaregesteuert und ermöglicht eine hohe Flexibilität beim Aufbau des Arrays, den der Anwender damit seinen Bedürfnissen entsprechend individuell konfigurieren kann. So können z.B. die Länge der Oligonukleotide, die Zahl der erzeugten Nukleinsäure-Sonden oder interne Kontrollen optimal auf das jeweilige Experiment abgestimmt werden.

In einer Ausführungsform werden qualitativ hochwertige und in der Sequenz frei programmierbare Nukleinsäuren in Form von Oligonukleotiden mit 10-200 Basen Länge kostengünstig und effizient in einer Vielfalt von 10 oder mehr unterschiedlichen Sequenzen bereitgestellt, um synthetische kodierende doppelsträngige DNA (synthetische Gene) herzustellen.

Der Aufbau von doppelsträngiger DNA aus Oligonukleotiden ist seit den 60er Jahren des letzten Jahrhunderts bekannt (Arbeiten von Khorana und anderen; siehe „Shabarova: Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids", VCH Weinheim). Er geschieht in der Mehrzahl der Fälle mit einem von zwei Verfahren (siehe Holowachuk et. al., PCR Methods and Applications, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Einmal erfolgt die Synthese des gesamten Doppelstrangs durch Synthese von einzelsträngigen Nukleinsäuren (geeigneter Sequenz), Aneinanderlagerung durch Hybridisieren komplementärer Bereiche dieser Einzelstränge und Verbinden des molekularen Rückgrats durch Enzyme, meist Ligase.

Demgegenüber gibt es auch die Möglichkeit einer Synthese von an den Rändern überlappenden Bereichen als einzelsträngige Nukleinsäuren, Aneinanderlagerung durch Hybridisieren, Auffüllen der einzelsträngigen Bereiche durch Enzyme (Polymerasen) und dann Verbinden des Rückgrats durch Enzyme, meist Ligase.

Ein bevorzugter Ablauf einer Gensynthese gemäß der Erfindung ist wie folgt: Allgemein wird im Rahmen eines modularen Systems eine Synthese vieler einzelner Nukleinsäurestränge durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur hochparallelen DNA-Synthese auf Matrizenbasis durchgeführt. Es entstehen als Reaktionsprodukte Sets von Nukleinsäuren, die als Bausteine in einem nachgeschalteten Prozess dienen. Damit wird eine Sequenz-Matrix erzeugt, die über 100.000 unterschiedliche Sequenzen enthalten kann. Die Nukleinsäuren liegen in einzelsträngiger Form vor und können aus dem Träger eluiert werden oder direkt im Reaktionsträger zur Reaktion gebracht werden. Durch wiederholtes Kopieren in einem oder mehreren Arbeitsgängen kann die Matrize mehrfach abgeschrieben werden, ohne diese zu zerstören, und gleichzeitig wird eine Vermehrung der jeweiligen in der Matrix kodierten Sequenzen erreicht. Wie an anderer Stelle ausführlicher beschrieben, kann durch Kopieren von distal nach proximal dabei auch der Anteil an verkürzten Nukleinsäurepolymeren an der festen Phase ausgeblendet werden, wenn distal die Kopier-Initiationsstelle liegt. Eine Beispiel hierfür ist eine distal angefügte Promoter-Sequenz.

Der Träger mit der Matrix an festphasengebundenen Molekülen kann für spätere erneute Verwendung aufbewahrt werden. Somit wird in einer effizienten Weise die Vielfalt an Sequenzen, die in einem Reaktionsträger durch eine in situ Synthese erzeugt wurde, für weitere Prozessschritte zur Verfügung gestellt. Gleichzeitig kann durch das Design der Kopierreaktion eine hohe Qualität der abgeschriebenen Sequenzen erzielt werden.

Danach werden geeignete Kombinationen der abgelösten DNA-Stränge gebildet. Die Zusammenlagerung der einzelsträngigen Bausteine zu doppelsträngigen Bausteinen erfolgt innerhalb eines Reaktionsraums; der in einem einfachen Ansatz ein übliches Reaktionsgefäß, z.B. ein Plastikröhrchen, sein kann. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Reaktionsraum Teil des Reaktionsträgers, der in einer Variante ein mikrofluidischer Reaktionsträger sein kann, in dem die notwendigen Reaktionen ablaufen. Ein weiterer Vorteil eines integrierten mikrofluidischen Reaktionsträgers ist die Möglichkeit der Integration weiterer Prozessschritte, wie z.B. eine Qualitätskontrolle durch optische Analytik. In einer Ausführungsform hat bereits die Synthese der Matrix in einem mikrofluidischen Träger stattgefunden, der dann gleichzeitig als Reaktionsraum für die nachgeschaltete Zusammenlagerung nutzbar ist.

Die Sequenz der einzelnen Bausteine wird dabei so gewählt, dass beim Inkontaktbringen der einzelnen Bausteine zueinander komplementäre Bereiche an den beiden zusammengebrachten Enden zur Verfügung stehen, um durch Hybridisierung dieser Bereiche eine spezifische Aneinanderlagerung von DNA-Strängen zu ermöglichen. Damit entstehen längere DNA-Hybride. Das Phosphodiester-Rückgrat des DNA-Moleküls wird durch Ligasen geschlossen. Sollten die Sequenzen so gewählt werden, dass in diesen Hybriden einzelsträngige Lücken bestehen, so werden diese Lücken in bekannter Vorgehensweise enzymatisch mittels Polymerasen aufgefüllt. (z.B. Klenow-Fragment oder Sequenase). So entstehen längere doppelsträngige DNA-Moleküle. Sollte es für die weitere Verwendung notwendig sein, diese verlängerten DNA-Stränge als Einzelstränge vorzulegen, so kann dies mit den dem Fachmann bekannten Verfahren zum Aufschmelzen von DNA-Doppelsträngen geschehen, wie z.B. Temperatur oder Alkali.

Durch die Zusammenführung von Clustern an derart synthetisierten DNA-Strängen innerhalb von Reaktionsräumen können wiederum längere Teilsequenzen des finalen DNA-Moleküls erzeugt werden. Dies kann stufenweise geschehen, und die Teilsequenzen werden dabei zu immer längeren DNA-Molekülen zusammengesetzt. Auf diese Weise lassen sich sehr lange DNA-Sequenzen als vollsynthetisches Molekül mit einer Länge von über 100.000 Basenpaaren erzeugen. Dies entspricht bereits dem Größenbereich eines Bacterial Artificial Chromosome BAC. Für den Aufbau einer Sequenz von 100.000 Basenpaaren aus überlappenden Bausteinen von 20 Nukleotiden Länge werden 10.000 individuelle Bausteine benötigt.

Dies kann mit den meisten der eingangs beschriebenen hochparallelen Synthese-Verfahren geleistet werden. Besonders bevorzugt sind für das erfindungsgemäße Verfahren dabei diejenigen Technologien, die den Array aus Nukleinsäurepolymeren in einer weitgehend frei programmierbaren Weise erzeugen und nicht auf das Einrichten von technischen Komponenten, wie z.B. photolithographischer Masken, angewiesen sind. Demnach sind besonders bevorzugte Ausführungsformen auf die projektorbasierte lichtgestützte Synthese, die indirekte projektorbasierte lichtgesteuerte Synthese mittels Photosäuren und Reaktionskammern in einem mikrofluidischen Reaktionsträger, die elektronisch induzierte Synthese mittels ortsaufgelöster Deprotektion an einzelnen Elektroden auf dem Träger und die fluidische Synthese mittels ortsaufgelöster Deposition der aktivierten Synthese-Monomere aufgebaut.

Für die rationelle Bearbeitung genetischer Moleküle und die systematische Erfassung aller möglichen Varianten müssen die Bausteine in ihrer individuellen Sequenz flexibel und ökonomisch hergestellt werden. Dies leistet das Verfahren durch den Einsatz einer programmierbaren Lichtquellenmatrix für die lichtabhängige ortsaufgelöste in situ Synthese der DNA-Stränge, die als Bausteine Verwendung finden. Diese flexible Synthese erlaubt die freie Programmierung der individuellen Sequenzen der Bausteine und damit auch die Erzeugung von beliebigen Varianten der Teilsequenzen oder der finalen Sequenz, ohne dass damit wesentliche Veränderungen von Komponenten des Systems (Hardware) verbunden wären. Nur durch diese programmierte Synthese der Bausteine und damit der finalen Syntheseprodukte kann die Vielfalt genetischer Elemente systematisch bearbeitet werden. Gleichzeitig erlaubt die Verwendung der computergesteuert programmierbaren Synthese die Automatisierung des gesamten Prozesses inklusive der Kommunikation mit entsprechenden Datenbanken.

Die Auswahl der Sequenz der einzelnen Bausteine kann bei Vorgabe der Zielsequenz rationell unter Berücksichtigung von biochemischen und funktionellen Parametern erfolgen. Dabei sucht ein Algorithmus nach Eingabe der Zielsequenz (z.B. aus einer Datenbank) die geeigneten Überlappungsbereiche heraus. Je nach der Aufgabenstellung können unterschiedlich viele Teilsequenzen erstellt werden, und zwar innerhalb eines zu belichtenden Reaktionsträgers oder auf mehrere Reaktionsträger verteilt. Die Anlagerungsbedingungen für die Bildung der Hybride, wie z.B. Temperatur, Salzkonzentration etc., werden durch einen entsprechenden Algorithmus auf die zur Verfügung stehenden Überlappungsbereiche abgestimmt. So wird eine maximale Spezifität der Aneinanderlagerung gewährleistet. Die Daten für die Zielsequenz können in einer vollautomatischen Version auch direkt aus öffentlichen oder privaten Datenbanken entnommen und in entsprechende Zielsequenzen umgewandelt werden. Die entstehenden Produkte können wiederum optional in entsprechend automatisierte Abläufe eingespeist werden, z.B. in die Klonierung in geeigneten Zielzellen.

Der stufenweise Aufbau durch Synthese der einzelnen DNA-Stränge in Reaktionsbereichen innerhalb umgrenzter Reaktionsräume erlaubt auch den Aufbau schwieriger Sequenzen, z.B. solche mit internen Wiederholungen von Sequenzabschnitten, wie sie z.B. bei Retroviren und entsprechenden retroviralen Vektoren vorkommen. Durch die Ablösung der Bausteine innerhalb der fluidischen Reaktionsräume kann eine Synthese beliebiger Sequenz erfolgen, ohne dass Probleme durch die Zuordnung der überlappenden Bereiche auf den einzelnen Bausteinen entstehen.

Die hohen Qualitätsanforderungen, die beim Aufbau sehr langer DNA-Moleküle notwendig sind, werden u.a. durch die Verwendung einer Echtzeit-Qualitätskontrolle erfüllt. Dabei wird die ortsaufgelöste Synthese der Bausteine überwacht, ebenso die Ablösung und die Zusammenlagerung bis hin zur Erstellung der finalen Sequenz. Dann laufen alle Prozesse in einem lichtdurchlässigen Reaktionsträger ab. Des Weiteren wird die Möglichkeit geschaffen, im Durchlicht Reaktionen und fluidische Vorgänge durch z.B. eine CCD-Detektion zu verfolgen.

Der miniaturisierte Reaktionsträger wird so ausgeführt, dass ein Ablösevorgang in den einzelnen Reaktionsräumen möglich ist, und somit die auf den innerhalb dieser Reaktionsräume liegenden Reaktionsbereichen synthetisierten DNA-Stränge in Clustern abgelöst werden. Bei geeigneter Ausführung des Reaktionsträgers ist die Zusammenlagerung der Bausteine in einem stufenweisen Prozess in Reaktionsräumen möglich, außerdem die Entnahme von Bausteinen, Teilsequenzen oder des finalen Produktes, oder auch die Sortierung bzw. Auftrennung der Moleküle.

Die Zielsequenz kann nach ihrer Fertigstellung als integriertes genetisches Element durch Transfer in Zellen eingebracht und dadurch kloniert und im Zuge funktioneller Studien untersucht werden. Eine weitere Möglichkeit ist es, das Syntheseprodukt zuerst weiter aufzureinigen oder zu analysieren, wobei diese Analyse z.B. eine Sequenzierung sein kann. Der Prozess der Sequenzierung kann auch durch direkte Kopplung mit einem entsprechenden Gerät beginnen, z.B. mit einer nach dem in der Patentanmeldung DE 199 24 327 arbeitenden Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analyse von Polymeren. Es ist ebenfalls denkbar, die erzeugten Zielsequenzen nach der Klonierung zu isolieren und zu analysieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt über die damit erzeugten integrierten genetischen Elemente ein Werkzeug zur Verfügung, das für die Weiterentwicklung der molekularen Biologie die biologische Vielfalt in einem systematischen Prozess erfasst. Die Erzeugung von DNA-Molekülen mit gewünschter genetischer Information ist damit nicht mehr der Engpass molekularbiologischer Arbeiten, da von kleinen Plasmiden über komplexe Vektoren bis zu Mini-Chromosomen alle Moleküle synthetisch erzeugt werden können und für weitere Arbeiten zur Verfügung stehen.

Das Herstellungsverfahren erlaubt die parallele Erzeugung von zahlreichen Nukleinsäuremolekülen und damit einen systematischen Ansatz für Fragestellungen betreffend Regulationselemente, DNA-Bindestellen für Regulatoren, Signalkaskaden, Rezeptoren, Wirkung und Interaktionen von Wachstumsfaktoren etc.

Durch die Integration von genetischen Elementen in eine vollsynthetische Gesamt-Nukleinsäure können die bekannten genetischen Werkzeuge, wie Plasmide und Vektoren, weiter genutzt und es kann so auf die entsprechenden Erfahrungen aufgebaut werden. Andererseits werden sich diese Erfahrungen durch die angestrebte Optimierung der vorhandenen Vektoren etc. rasch verändern. Die Mechanismen, die z.B. ein Plasmid für die Propagation in einem bestimmten Zelltyp geeignet machen, lassen sich auf der Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens erstmals rationell untersuchen.

Durch diese rationelle Untersuchung großer Varianten-Zahlen lässt sich der gesamte Kombinationsraum genetischer Elemente erschließen. Damit wird neben die zur Zeit in rascher Entwicklung befindliche hochparallele Analytik (u.a. auf DNA-Arrays oder DNA-Chips) als zweites wichtiges Element die programmierte Synthese integrierter genetischer Elemente geschaffen. Nur beide Elemente zusammen können das Fundament einer rationellen molekularen Biologie bilden.

Bei der programmierten Synthese von entsprechenden DNA-Molekülen ist nicht nur die beliebige Zusammensetzung der kodierenden Sequenzen und funktionellen Elemente möglich, sondern auch die Anpassung der Zwischenbereiche. Dies sollte rasch zu Minimal-Vektoren und Minimal-Genomen führen, womit wiederum Vorteile durch die geringere Größe entstehen. Übertragungsvehikel, wie z.B. virale Vektoren, können dadurch effizienter gemacht werden, z.B. bei Verwendung von retroviralen oder adenoviralen Vektoren.

Über die Kombination bekannter genetischer Sequenzen hinaus ist die Entwicklung neuer genetischer Elemente möglich, die auf der Funktion vorhandener aufbauen kann. Gerade für solche Entwicklungsarbeiten ist die Flexibilität des Systems von enormem Wert.

Die synthetischen DNA-Moleküle sind dabei auf jeder Stufe der Entwicklung des hier beschriebenen Verfahrens voll kompatibel mit der vorhandenen Rekombinationstechnologie. Auch für „traditionelle" molekularbiologische Anwendungen können integrierte genetische Elemente bereitgestellt werden, z.B. durch entsprechende Vektoren. Der Einbau entsprechender Schnittstellen auch für bisher wenig verwendete Enzyme ist bei integrierten genetischen Elementen kein limitierender Faktor.

Ermöglicht wird mit diesem Verfahren die Integration aller gewünschten funktionellen Elemente als „genetische Module", wie z.B. Gene, Teile von Genen, Regulationselemente, virale Verpackungssignale etc., in das synthetisierte Nukleinsäuremolekül als Träger genetischer Information. Durch diese Integration ergeben sich u.a. folgende Vorteile:
Es können damit hochgradig funktionsintegrierte DNA-Moleküle entwickelt werden, wobei unnötige DNA-Bereiche wegfallen (Minimal-Gene, Minimal-Genome).

Die freie Kombination der genetischen Elemente sowie die Veränderungen der Sequenz, wie z.B. zur Anpassung an den exprimierenden Organismus/Zelltyp (Codonnutzung), werden ebenso ermöglicht wie Veränderungen der Sequenz zur Optimierung funktioneller genetischer Parameter, wie beispielsweise Genregulation.

Ebenfalls ermöglicht werden Veränderungen der Sequenz zur Optimierung funktioneller Parameter des Transkripts, z.B. Spleißen, Regulation auf mRNA-Ebene, Regulation auf Translationsebene, und darüber hinaus die Optimierung funktioneller Parameter des Genprodukts, wie z.B. die Aminosäuresequenz (z.B. Antikörper, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, Kanäle, Poren, Transporter etc.).

Darüber hinaus ist es möglich, Konstrukte zu erstellen, die über den RNAi-Mechanismus in die Genexpression eingreifen. Wenn solche Konstrukte für mehr als eine RNAi-Spezies kodieren, können in einem Multiplex-Ansatz mehrere Gene gleichzeitig inhibiert werden.

Insgesamt ist das mit dem Verfahren realisierte System extrem flexibel und erlaubt in bisher nicht vorhandener Weise die programmierte Erstellung von genetischem Material mit stark verringertem Aufwand an Zeit, Materialien und Arbeit.

Größere DNA-Moleküle, wie z.B. Chromosomen von mehreren hundert kbp, waren mit den vorhandenen Methoden nahezu nicht gezielt manipulierbar. Bereits komplexere (d.h. größere) virale Genome von mehr als 30 kbp (z.B. Adenoviren) sind mit den klassischen Methoden der Gentechnik schwierig zu handhaben und zu manipulieren.

Es kommt zu einer erhebliche Verkürzung bis zur letzten Stufe der Klonierung eines Gens: Das Gen oder die Gene werden als DNA-Molekül synthetisiert und dann (nach geeigneter Vorbereitung, wie Reinigung etc.) direkt in Zielzellen eingebracht und das Ergebnis studiert. Der mehrstufige, meist über Mikroorganismen, wie E.coli, laufende Klonierungsprozess (z.B. DNA-Isolation, Reinigung, Analyse, Rekombination, Klonierung in Bakterien, Isolation, Analyse etc.) wird damit auf die letzte Übertragung des DNA-Moleküls in die finalen Effektorzellen reduziert. Bei synthetisch hergestellten Genen oder Genfragmenten ist eine klonale Vermehrung in einem Zwischenwirt (zumeist E.coli) nicht mehr notwendig. Damit umgeht man die Gefahr, dass das für die Zielzelle bestimmte Genprodukt eine toxische Wirkung auf den Zwischenwirt ausübt. Damit hebt man sich deutlich ab von der Toxizität mancher Genprodukte, die bei der Verwendung klassischer Plasmid-Vektoren häufig zu erheblichen Problemen bei der Klonierung der entsprechenden Nukleinsäurefragmente führt.

Eine weitere erhebliche Verbesserung ist die Zeitverkürzung und die Reduktion der Arbeitsschritte, bis nach dem Sequenzieren von genetischem Material die dabei vorgefundenen potentiellen Gene als solche verifiziert und kloniert werden. Normalerweise werden nach Auffinden interessierender Muster, die als ORF in Frage kommen, mit Sonden (z.B. mittels PCR) in cDNA-Bibliotheken entsprechende Klone gesucht, die allerdings nicht die ganze Sequenz der ursprünglich bei ihrer Herstellung verwendeten Boten-RNA (messenger RNA, mRNA) enthalten müssen (Problem der „full lenght clones"). Bei anderen Verfahren wird mittels eines Antikörpers in einer Expressions-Genbibliothek gesucht (Screening). Beide Verfahren lassen sich mit dem erfahrungsgemäßen Verfahren extrem abkürzen: bei Vorliegen einer „in silico" bestimmten Gen-Sequenz (d.h. nach der Erkennung eines entsprechenden Musters in einer DNA Sequenz durch den Computer), oder nach Entschlüsselung einer Proteinsequenz, kann ein entsprechender Vektor mit der Sequenz oder Varianten davon direkt über programmierte Synthese eines integrierten genetischen Elementes erzeugt und in geeignete Zielzellen eingebracht werden.

Die so erfolgende Synthese von DNA-Molekülen bis zu mehreren 100 kbp erlaubt die direkte Komplett-Synthese von viralen Genomen, z.B. Adenoviren. Diese sind ein wichtiges Werkzeug in der Grundlagenforschung (u.a. Gentherapie), aber wegen der Größe ihres Genoms (ca. 40 kbp) schwer mit klassischen Methoden der Gentechnik zu handhaben. Besonders die rasche und ökonomische Erzeugung von Varianten zur Optimierung ist dadurch stark limitiert. Diese Limitierung wird durch das erfindungsgemäße Verfahren aufgehoben.

Durch das Verfahren erfolgen die Integration der Synthese, die Ablösung der Syntheseprodukte und die Zusammenlagerung zu einem DNA-Molekül in einem System. Mit Herstellungsverfahren der Mikrosystemtechnik können alle notwendigen Funktionen und Verfahrensschritte bis zur Aufreinigung des finalen Produktes in einem miniaturisierten Reaktionsträger integriert werden. Dies können Synthesebereiche, Ablösungsbereiche (Cluster), Reaktionsräume, Zuführungskanäle, Ventile, Pumpen, Konzentratoren, Auftrennungsbereiche etc. sein.

Plasmide und Expressionsvektoren können für sequenzierte Proteine oder entsprechende Teilsequenzen direkt hergestellt und die Produkte biochemisch und funktionell analysiert werden, z.B. unter Verwendung geeigneter Regulationselemente. Damit fällt die Suche nach Klonen in einer Gen-Bibliothek weg. Entsprechend können offene Leseraster („open reading frames” ORF) aus Sequenzierarbeiten (z.B. Humangenomprojekt) direkt in entsprechende Vektoren programmiert und mit gewünschten genetischen Elementen kombiniert werden. Eine Identifikation von Klonen, z.B. in durch aufwendiges Screening von cDNA Bibliotheken, entfällt. Damit ist der Informationsfluss von der Sequenz-Analyse zur Funktions-Analyse stark verkürzt worden, denn am selben Tag, an dem ein ORF durch Analyse von Primärdaten im Computer vorliegt, kann ein entsprechender Vektor inklusive des vermuteten Gens synthetisiert und zur Verfügung gestellt werden.

Gegenüber konventioneller Festphasen-Synthese zur Gewinnung synthetischer DNA zeichnet sich das Verfahren gemäß Erfindung durch geringeren Materialaufwand aus. Zur Herstellung tausender von unterschiedlichen Bausteinen für die Erzeugung von einem komplexen integrierten genetischen Element mit mehreren 100.000 kbp Länge, in entsprechend parallelisiertem Format und bei entsprechender Miniaturisierung (siehe Ausführungsbeispiele), braucht ein mikrofluidisches System deutlich weniger Einsatzstoffe als ein konventioneller Festphasensynthese-Automat für einen einzelnen DNA-Oligomer (bei Verwendung einer einzigen Säule). Hier stehen Mikroliter dem Verbrauch von Millilitern gegenüber, d.h. ein Faktor von 1000.

Unter Berücksichtigung neuester Erkenntnisse der Immunologie erlaubt das vorgestellte Verfahren ein extrem rationelles und schnelles Impfstoff-Design (DNA-Vakzine).