Title:
Sandel-Duftstoffrezeptoren
Kind Code:
A1


Abstract:

Die Erfindung betrifft das Gebiet der olfaktorischen Rezeptoren, der empfängnisbeeinflussenden Medikamente und der Biosensoren. Die Erfindung betrifft ferner Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei
X bedeutet: -OH, -COR2 oder C(OH)R3R4,
R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten
und alternativ X und R5 zusammen eine Ketogruppe (=O) bedeuten können und wobei ferner
die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie eine Doppelbindung an einer der beiden Positionen bedeutet, und Verwendungen dieser Verbindungen.




Inventors:
Hatt, Hanns (Bochum, 44789, DE)
Panten, Johannes (Höxter, 37671, DE)
Application Number:
DE102006037580
Publication Date:
02/21/2008
Filing Date:
08/11/2006
Assignee:
Symrise GmbH & Co. KG (Holzminden, 37603, DE)



Attorney, Agent or Firm:
Eisenführ, Speiser & Partner (Bremen, 28195)
Claims:
1. Verwendung einer Substanz der Formel (I) wobei
X bedeutet: -OH, -COR2 oder C(OH)R3R4,
R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten,
und alternativ X und R5 zusammen eine Ketongruppe (=O) bedeuten können, und wobei ferner
die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie eine Doppelbindung an einer der beiden Positionen bedeutet,
a) zum Binden an und/oder zum Aktivieren eines OR10J1-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors,
b) zum Auslösen oder Erhöhen der Bildung von Cycloadenosinmonophosphat und/oder zum Auslösen eines Einstroms oder Erhöhen der Konzentration an Ca2+ in einer Zelle, die einen OR10J1-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors exprimiert,
c) zum Steigern der Geißelschlagfrequenz eines Spermiums, und/oder
d) zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer niedrigen Spermiengeißelschlagfrequenz.

2. Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wobei R1 H oder CH3 bedeutet, und

3. Expressionssystem umfassend eine Zelle, die einen OR10J1-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors exprimiert, wobei
a) der Duftstoffrezeptor heterolog in bezug auf die Zelle ist oder
b) der Duftstoffrezeptor in der Zelle überexprimiert wird.

4. Expressionssystem nach Anspruch 3, wobei die Zelle eine gegebenenfalls entartete Säugerzelle ist.

5. Vektor umfassend einen Nucleinsäureabschnitt codierend für einen OR10J1-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors.

6. Nucleinsäure der Sequenz SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 2, oder SEQ ID NO. 4.

7. Verwendung einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 6 oder SEQ ID NO 3 zum Nachweisen eines Nucleinsäureabschnitts codierend für einen OR10J1-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors.

8. Biosensor zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, umfassend
a) ein Expressionssystem nach einem der Ansprüche 3 oder 4, und
b) Mittel zum Nachweisen einer Bindung der Verbindung der Formel (I) an den besagten Duftstoffrezeptor des Expressionssystems.

9. Arzneimittel umfassend eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder eines Salzes der jeweiligen Verbindung, in einer pharmazeutisch wirksamen Menge.

10. Verwendung eines OR10J1-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors zum Nachweisen und/oder zum Binden an eine Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1.

11. Verfahren zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 3 bis 4,
b) Inkontaktbringen des Expressionssystems mit einer Probe, die gegebenenfalls eine besagte Verbindung der Formel (I) enthält, und
c) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) an den besagten Duftstoffrezeptor des Expressionssystems gebunden hat.

12. Verfahren zum Nachweisen eines Antagonisten eines OR10J1-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen des erfindungsgemäßen Rezeptors,
b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen ein gegebenenfalls in der Probe enthaltener Antagonist spezifisch an den Rezeptor bindet,
c) Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer Verbindung der Formel (I), um der Verbindung ein spezifisches Binden an den Rezeptor zu ermöglichen, falls kein Antagonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, und
d) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) und/oder ein Antagonist eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.

Description:

Die Erfindung betrifft das Gebiet der olfaktorischen Rezeptoren, der empfängnisbeeinflussenden Medikamente und der Biosensoren.

Seit der Entdeckung der für olfaktorische Rezeptoren (Duftstoffrezeptoren) codierenden DNA-Sequenzen (Gene) sind zahlreiche Aspekte im Zusammenhang mit diesen Rezeptoren noch immer ungeklärt. Zwar kann der Fachmann mit einiger Sicherheit anhand charakteristischer Merkmale – beispielsweise Zugehörigkeit zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, Hypervariabilität in den Transmembran-Domänen III, IV, V und VI – zwischen DNA-Sequenzen von Duftstoffrezeptoren und solchen Sequenzen, die nicht für einen Duftstoffrezeptor codieren, unterscheiden. Damit ist jedoch noch nichts substantiell über die Regulation der Duftstoffrezeptor-Expression bekannt; insbesondere ist unbekannt, in welchem Gewebe und in welcher Stärke ein vermutetes Duftstoffrezeptor-Gen exprimiert wird; ferner ist nicht vorhersagbar, welche Substanzen an den von diesem Gen codierten Duftstoffrezeptor spezifisch binden können, sei es als Agonist (Aktivator) oder als Antagonist (Inhibitor).

Duftstoffrezeptor-Gene von Vertebraten lassen sich zwar durch degenerierte PCR (Polymerase-Kettenreaktion) verhältnismäßig leicht subklonieren (Mombaerts, Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors, Nat. Rev. Neurosci. 5(2004), 263–278). Es hat sich jedoch bisher als sehr schwierig herausgestellt, einem isolierten Duftstoffrezeptor einen zugehörigen, von dem Rezeptor nachweisbaren Duftstoff (Liganden) zuzuordnen. Beispielsweise vergingen sieben Jahre zwischen der ersten funktionalen Beschreibung eines Duftstoffrezeptor-Gens und der Angabe seines zugehörigen Duftstoff-Liganden (Zhao et al., Functional expression of a mammalian odorant receptor; Science 279(1998), 237–242). Bisher ist erst bei zwei menschlichen Duftstoffrezeptor-Genen eine Zuordnung entsprechender Duftstoffe zu Duftstoffrezeptoren gelungen:
Wetzel et al (The Journal of Neuroscience, 1999: 7426-7433) beschreiben die funktionelle Expression des menschlichen hOR17-40 Rezeptor-Proteins. Es konnten nur zwei als Agonisten wirkende Substanzen bestimmt werden, nämlich Helional und Heliotropylaceton. Diese Substanzen lösen eine Aktivierung des Rezeptors aus, die sich in einer vorübergehenden Erhöhung des cytosolischen Ca2+-Spiegels niederschlägt, wenn der Rezeptor funktionell in HEK293-Zellen exprimiert wird. Antagonisten, also Substanzen, die eine Rezeptor-Aktivierung durch einen oder mehrere Agonisten spezifisch und reversibel verhindern können, wurden nicht gefunden. Spehr et al (Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis; Science 299(2003), 2054–2058) wiederum konnten die Bindung von Bourgeonal an einen weiteren menschlichen Duftstoffrezeptor (hOR17-4) und die antagonistische Wirkung von n-Undecanal auf diese Ligandenbindung nachweisen.

Die funktionelle Expression von Duftstoffrezeptor-Genen in heterologen Systemen ist jedoch trotz ständigen Bemühens der Fachwelt bisher nicht zuverlässig gelungen (Mombaerts, a.a.O.). Ferner ist es nach wie vor nicht möglich, anhand der DNA-Sequenz bzw. der Rezeptor-Aminosäuresequenz Vorhersagen darüber zu treffen, welche Substanzen als Agonisten oder Antagonisten wirken können. Beispielsweise sind Befunde, die anhand von Testikulargeweben von Mäusen gewonnen wurden, kaum auf andere Spezies übertragbar, da Spermazellen anfällig für zufällige Genexpression sind und in Spermien gefundene Duftstoffrezeptor-Gene schwer den übrigen Duftstoffrezeptor-Genfamilien zugeordnet werden können (Vanderhaeghen et al, Specific repertoire of olfactory receptor genes in the male germ cells of several mammalian species; Genomics 39 (1997), 239–246).

Es besteht daher ein großer Bedarf, weitere Duftstoffrezeptoren zu finden, funktionell zu exprimieren und die jeweils wirksamen Agonisten und Antagonisten zu bestimmen.

Erfindungsgemäß wird deshalb ein Expressionssystem angegeben umfassend eine Zelle, die einen OR10J1- Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors exprimiert, wobei

  • a) der Duftstoffrezeptor heterolog in bezug auf die Zelle ist oder
  • b) der Duftstoffrezeptor in der Zelle überexprimiert wird.

Ausgangspunkt hierbei war die unter der Bezeichnung OR10J1 veröffentlichte Nucleinsäuresequenz (Genbank Accession-Nummer BC112290; Malnic, B., Godfrey, P.A. and Buck, L.B.; the human olfactory receptor gene family; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (8), 2584–2589 (2004)) des für den Rezeptor codierenden Gens (Gensequenz) eines menschlichen Duftstoffrezeptors. Eine synonyme Bezeichnung ist OR1-26 (wegen der Nomenklatur siehe Ben-Arie et al., Human Molecular Genetics (1994), 229-235). Der Rezeptor gehört zu der eingangs beschriebenen Klasse von Proteinen, die zur Superklasse der G-Protein-gekoppelten Proteine mit sieben vermuteten Transmembrandomänen gehören. Da nunmehr die funktionelle Expression dieses Rezeptors erstmals gelungen ist, wurde es auch möglich, Substanzen zu finden, die als Agonist oder Antagonist spezifisch an den Rezeptor binden können; hierzu unten mehr.

Der Fachmann erkennt, dass auch ein Protein, das einen Proteinabschnitt mit einer von der Sequenz von OR10J1 abweichenden Aminosäuresequenz besitzt, ein Duftstoffrezeptor mit der im weiteren Verlauf beschriebenen Duftstoff-Ligandenspezifität sein kann. Die Erfolgsaussichten, einen funktionalen Rezeptor zu erhalten, insbesondere einen Duftstoffrezeptor, ist in der Gruppe der Proteine mit einem Abschnitt mit homologer Aminosäuresequenz zu OR10J1 höher als in der Gruppe der Proteine ohne oder mit nur geringer Homologie zur Sequenz dieses Duftstoffrezeptors. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein ist dementsprechend auch ein Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors Die Transmembrandomäne III beginnt bei Aminosäure 109 und die Transmembrandomäne VI endet bei Aminosäure 269 des OR10J1-Proteins. Besonders bevorzugt sind dabei solche Proteine, die einen Proteinabschnitt mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von 90% und besonders bevorzugt von 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäure Unterschied zu einem Proteinabschnitt bestehend aus den Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors besitzen. Die Aminosäure-Sequenzhomologie kann zweckmäßigerweise mit Hilfe des EMBOSS:water-Programms (Algorithmus von Smith und Waterman (1981), Identification of common molecular subsequences, J. Mol. Biol. 147:195–197) berechnet werden (Gap open penalty: 10.0; Gap extension penalty: 0.5; Blosum62-Matrix). Das Programm berechnet einen "Similarity"-Prozentwert, dieser ist das Maß der Homologie. Ein "Similarity"-Prozentwert von 80% bedeutet also im Sinne dieser Erfindung eine Sequenzhomologie von 80%.

Erfindungsgemäß wird zudem ein Fusionsprotein angegeben a) umfassend die Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors oder einen Proteinabschnitt mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 70 %, vorzugsweise von 90% und besonders bevorzugt von 5, 4, 3, 2 oder 1 Aminosäure Unterschied zu dem Proteinabschnitt bestehend aus den Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors, wobei b) der Abschnitt gemäß a) zwischen den Transmembrandomänen I und VI hOR17-40 (Wetzel et al., s.o.) angeordnet ist und zwischen der Transmembrandomäne I aus hOR17-40 und der Transmembrandomäne III gemäß a) eine weitere funktionale Transmembrandomäne angeordnet ist. Zum Herstellen und zur Verwendung solcher Fusionsproteine wird sich der Fachmann insbesondere an der Beschreibung der WO 2004-033496A1 orientieren, deren Inhalt in soweit in Bezug genommen wird. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein erleichtert insbesondere das Herstellen eines erfindungsgemäßen Expressionssystems.

Soweit in dieser Beschreibung von einem Rezeptor oder erfindungsgemäßen Rezeptor gesprochen wird, ist damit der OR10J1-Rezeptor, ein Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein der oben beschriebenen Art gemeint, soweit nicht im jeweiligen Textzusammenhang klar ein anderes angegeben ist.

Wird der Rezeptor als heterologes Protein in einer Wirtszelle exprimiert – auch hierzu unten mehr –, so ist es möglich, dass die Transkription und/oder Translation bestimmter Nucleinsäure-Codons bzw. Codon-Abfolgen effizienter vonstatten geht als die Transkription und/oder Translation anderer Codons bzw. Codon-Abfolgen. Hieraus kann sich eine Präferenz für bestimmte Aminosäuren und/oder Aminosäureabfolgen ergeben. Es ist nunmehr bevorzugt, wenn einige oder alle Aminosäuren des Rezeptors, für die keine Präferenz der Wirtszelle besteht, durch solche Aminosäuren ersetzt sind, für die eine Präferenz der Wirtszelle besteht. Ferner kann es vorteilhaft sein, eine Protease-Schnittstelle durch einen Aminosäureaustausch, -deletion oder -insertion zu entfernen.

Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Fusionsprotein, das ferner einen oder mehrere weitere Proteinabschnitte umfasst. Hierbei kann es sich insbesondere um Signalpeptide wie die "5HT3-Sequenz" (vergleiche C. H. Wetzel et al., Journal of Neuroscience 19, 7426-7433 (1999)) handeln, die den Transport und den funktionellen Einbau in die Zellmembran erleichtert. Anstelle oder neben der "5HT3-Sequenz" können jedoch auch andere Signalpeptide verwendet werden, insbesondere solche, die einen intra- und/oder interzellulären Transport des Fusionsproteins steuern oder erleichtern.

Es hat sich nunmehr herausgestellt, dass der Rezeptor spezifisch an Verbindungen der nachfolgenden Formel (I) bindet: wobei
X bedeutet: -OH, -COR2 oder C(OH)R3R4,
R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten,
und alternativ X und R5 zusammen eine Ketogruppe (=O) bedeuten können, und wobei ferner
die in der Formel (I) eingezeichnete gestrichelte Linie eine Doppelbindung an einer der beiden Positionen bedeutet.

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein ist dementsprechend ein Rezeptor, der geeignet ist zum spezifischen Binden an eine Verbindung der Formel (I).

Unter einer spezifischen Bindung im Sinne dieser Erfindung wird eine Bindung verstanden, die – vereinfacht gesagt – nach einer Art Schlüssel-Schloss-Prinzip funktioniert. Insbesondere bindet der Rezeptor eine Substanz bzw. bindet eine Substanz an den Rezeptor dann spezifisch, wenn die Substanz bei Applikation auf mehrere Moleküle des Rezeptors bei niedrigen Konzentrationen, vorzugsweise bei Konzentrationen kleiner als 10 mM, besonders bevorzugt bei Konzentrationen kleiner oder gleich 1 mM, insbesondere bevorzugt bei Konzentrationen kleiner oder gleich 100 μM, mit großer Wahrscheinlichkeit immer wieder im gleichen Bereich des Rezeptors bindet. Das Ergebnis einer solchen spezifischen Bindung kann insbesondere eine – vorzugsweise reversible – nicht im wesentlichen lediglich auf den Ort der Bindung begrenzte Konformationsänderung des Rezeptors sein.

Ferner wird unter einem Agonisten im Sinne der Erfindung eine Substanz verstanden, die durch ihre spezifische Bindung an den Rezeptor eine über diese bloße Bindung hinausgehende chemische Reaktion auslöst. In ihrem natürlichen Umfeld stehen Rezeptoren nicht chemisch unvermittelt neben anderen Zellbestandteilen, sondern stehen in Wirkverbindung mit weiteren Teilen zumindest einer Signaltransduktionskaskade, wie sie beispielsweise durch G-Proteine vermittelt wird. Durch das spezifische Binden eines Agonisten werden solche Rezeptoren von einem inaktiven in einen aktiven Zustand überführt, dies geht gewöhnlich einher mit einer nicht im wesentlichen auf den Ort der Agonisten-Bindung begrenzten Konformationsänderung des Rezeptors und schlägt sich in einem Einschalten der Signaltransduktionskaskade nieder, erkennbar beispielsweise an einem Anstieg der cytosolischen Konzentration von Ca2+, cAMP, cGMP und/oder Inositol-Triphosphat oder der Änderung des ATP/ADP-Quotienten. Die Konformationsänderung des Rezeptors, und auch das Einschalten der Signaltransduktionskaskade, ist eine über die bloße Bindung des Agonisten hinausgehende chemische Reaktion. Agonisten im Sinne dieser Erfindung bezogen auf den Rezeptor sind insbesondere die Verbindungen der Formel (I).

Im Sinne der Erfindung ist ein Antagonist eine Substanz, die zwar spezifisch von einem Rezeptor gebunden wird, jedoch das spezifische Binden eines Agonisten an den Rezeptor erschwert. Das spezifische Binden des Antagonisten führt, anders als bei einem Agonisten, nicht zum Einschalten einer Signaltransduktionskaskade, wenn der Rezeptor Teil einer solchen, durch das spezifische Binden eines Agonisten eingeschalteten Signaltransduktionskaskade ist. Insbesondere kann eine durch das spezifische Binden eines Agonisten hervorgerufene Konformationsänderung des Rezeptors beim spezifischen Binden eines Antagonisten ausbleiben.

Insbesondere wurde eine Bindung des Rezeptors an die Verbindungen der nachfolgenden Formeln gefunden: wobei
X eine Gruppe -OH, -COR2
und R1, R2 und R5 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten,
und alternativ X und R5 zusammen eine Ketogruppe (=O) bedeuten können, ferner: wobei
R3 und R4 unabhängig voneinander H oder CH3 bedeuten.

Die Substanzen sowie ihre Verwendung als Riechstoffe sind größtenteils beschrieben, hauptsächlich in US 5,189,013 und DE 10 2005 026 801. Dort ist auch die Herstellung der hier genannten Substanzen beschrieben.

Eine besonders gute Bindung an den Rezeptor wurde erhalten mit folgenden Verbindungen der Formel B: wobei R1 H oder CH3 sein kann,
ferner wobei jeweils R1 H oder CH3 ein kann,
ferner wobei R2 gleich H oder CH3 bedeutet.

Eine ebenfalls gute Bindung an den Rezeptor konnte erhalten werden mit folgenden Verbindungen der Formel C: wobei R4 jeweils H oder CH3 bedeutet,
ferner wobei R4 jeweils H oder CH3 bedeutet.

Verbindungen der genannten Strukturen sind demgemäß für die Zwecke der Erfindung besonders bevorzugt.

Neu sind folgende Substanzen: wobei R1 H oder CH3 bedeutet, und

Für die Zwecke der Erfindung sind die Verbindungen der nachfolgenden Formeln B3a und B3b besonders bevorzugt: wobei R2 gleich H oder CH3 bedeutet.

Am meisten bevorzugt sind die Verbindungen der Formeln B3a und B3b mit R2 = CH3, insbesondere die Verbindung B3a mit R2 = CH3. Die Verbindung der Formel B3a mit X=CH3 wird nachfolgend auch PI-23472 genannt.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen der Formel C können beispielsweise durch ein Verfahren mit folgenden Schritten hergestellt werden: Bereitstellen oder Herstellen einer oder mehrerer Verbindungen der Formeln B3a oder B3b oder deren Mischung wobei R2 H oder CH3 bedeutet,

  • – Reduzieren, vorzugsweise mit Natriumborhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid, der Verbindung oder der Mischung der Formeln B3a und/oder B3b, so dass eine Verbindung bzw. Mischung der Formeln C1a und/oder C1b gebildet wird, wobei R4 die gleiche Bedeutung wie R2 in den Formeln B3a und/oder B3b besitzt; bzw.
  • – nukleophile Addition einer metallorganischen Verbindung mit Methylanionencharakter, vorzugsweise unter Verwendung eines Methylmagnesiumhalogenids wie Methylmagnesiumchlorid oder Methyllithium, an die Verbindung oder die in der Mischung enthaltenen Verbindungen der Formeln B3a und/oder B3b, so dass eine eine Verbindung bzw. Mischung der Formeln C2a und/oder C2b gebildet wird, wobei R4 die gleiche Bedeutung wie R2 in den Formeln B3a und/oder B3b besitzt.

Die nach diesem Verfahren hergestellten Verbindungen sind Mischungen, die eine Verbindung der Formel (Ia), und eine Verbindung der Formel (Ib) umfassen.

Zur Herstellung der Verbindungen der Formeln B3a und/oder B3b oder (bevorzugt) einer Mischung einer Verbindung der Formel B3a mit einer Verbindung der Formel B3b, wobei R2 H oder CH3 bedeutet, werden vorzugsweise die folgenden Schritte durchgeführt: Überführen einer Verbindung der Formel (X) mittels Olefinierungs-Reaktion in eine Verbindung der Formel (XI),

  • – Umsetzen der Verbindung der Formel (XI) mit einer Verbindung der Formel (XII) mittels Diels-Alder-Reaktion zu einer Mischung von Verbindungen der Formeln B3a und B3b, wobei in Formel (XII) R* die gleiche Bedeutung wie R2 in den Formeln B3a und/oder B3b, sowie gegebenenfalls
  • – Trennen der Verbindungen der Formeln B3a und B3b voneinander.

Im ersten Reaktionsschritt wird beispielsweise In der 1. Stufe wird nach dem Fachmann wohlvertrauten Methoden α-Methylencampholenaldehyd, das heisst die Verbindung (X) in einer Wittig Reaktion mit Methyltriphenylphosphoniumbromid und in Gegenwart von Kalium-tert-butanolat als Base umgesetzt umgesetzt (Synth. Commun. 1985, 15, 855–864). Dem Fachmann sind alternative Olefinierungs-Reaktionen zur Überführung der Verbindung der Formel (X) in die Verbindung der Formel (XI) bekannt.

Das als Ergebnis des ersten Reaktionsschrittes erhaltene Dien der Formel (XI) wird dann in einer Diels-Alder-Reaktion, typischerweise in Gegenwart von katalytischen Mengen Aluminiumtrichlorid, mit der α-,β-ungesättigten Carbonylverbindung der Formel (XII) umgesetzt, in der R* die oben genannte Bedeutung hat.

Ausgehend von der Verbindung der Formel (X) lässt sich in zwei Schritten eine Verbindung bzw. Mischung der Formel B3a oder B3b und in insgesamt drei Schritten eine Verbindung bzw. Mischung der Formel C herstellen. Das nachfolgende Schema 1 verdeutlicht die durchzuführenden Reaktionsschritte; die Angabe von Methyltriphenylphosphoniumbromid in Schema 1 ist dabei lediglich beispielhaft zu verstehen.

Das erhaltene Dien (XI) wird einer Diels-Alder Reaktion mit einer α-,β-ungesättigten Carbonylverbindiung der Formel (XII), wobei R1 die oben genannte Bedeutung hat, in Gegenwart von katalytischen Mengen Aluminiumtrichlorid unterworfen. Die resultierende Mischung der beiden Verbindungen (IXa) und (IXb) wird abschließend in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie z.B. Natriumborhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid unter Standardbedingungen reduziert oder in einer Grignard Reaktion mit Methylmagnesiumhalogenid, insbesondere Methylmagnesiumchlorid, ebenfalls unter Standardbedingungen umgesetzt. Somit erhält man als Produkt eine Mischung der Alkohole (Ia) und (Ib) (Schema 1).

Die Verbindungen der Formel (I), insbesondere die Verbindungen der Formeln B und C, werden erfindungsgemäß angegeben als Duftstoffe. Sie sind geeignet zum spezifischen Binden an einen Rezeptor wie oben beschrieben, insbesondere an ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein und zum Auslösen einer Signaltransduktionskaskade wie oben beschrieben. Ferner hat sich gezeigt, wie unten näher ausgeführt wird, dass Verbindungen der Formel (I) die Ca2+-Konzentration in einer den beschriebenen Rezeptor exprimierenden Zelle steigern und die Geißelschlagfrequenz eines Spermiums erhöhen können. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass Verbindungen der Formel B, insbesondere der Formel B3a, bei Verabreichung an Spermien den Rezeptor OR1D2 inhibieren, als Antagonist gegen Bourgeonal wirken und insbesondere die Bindung von Bourgeonal an den Rezeptor OR1D2 verhindern, die Bourgeonal-abhängige Aufnahme von Ca2+ in Spermien verringern oder ganz unterdrücken und die Bourgeonal-vermittelte Spermien-Chemotaxis unterdrücken können.

Erfindungsgemäß wird deshalb auch die Verwendung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Verbindungen der Formeln B und C, gelehrt

  • a) zum Binden an und/oder zum Aktivieren eines OR10J1-Duftstoffrezeptors oder eines Duftstoffrezeptors mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen IN bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
  • b) zum Auslösen oder Erhöhen der Bildung von Cycloadenosinmonophosphat und/oder zum Auslösen eines Einstroms oder Erhöhen der Konzentration an Ca2+ in einer Zelle, die einen OR10J1-Duftstoffrezeptor oder einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors oder ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert,
  • c) zum Steigern der Geißelschlagfrequenz eines Spermiums,
  • d) zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer niedrigen Spermiengeißelschlagfrequenz, und
  • e) als Inhibitor des OR1D2-Rezeptors.

Zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Expressionssystems ist es zweckmäßig, ein Gen für den Rezeptor durch einen Vektor in eine Wirtszelle einzuführen. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird deshalb ein Vektor angegeben, der einen Nucleinsäure-Abschnitt umfasst, der für einen Rezeptor nach einem der vorherigen Aspekte der Erfindung codiert, also ein Vektor umfassend einen Nucleinsäureabschnitt codierend für a) einen OR10J1-Duftstoffrezeptor oder b) einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors oder c) ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein. Ein solcher Vektor erleichtert es, eine für den erfindungsgemäßen Rezeptor codierende Nucleinsäure zu klonieren. Der Vektor kann auch ein sogenannter suicide-Vektor sein, insbesondere ein solcher, der die Integration des für den Rezeptor codierenden Nucleinsäure-Abschnitts in das Genom der Wirtszelle ermöglicht.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Vektor ein Expressionsvektor. Solche Vektoren ermöglichen die Transkription und Translation des im Vektor enthaltenen, für den erfindungsgemäßen Rezeptor codierenden Nucleinsäureabschnitts, wenn der Vektor in eine geeignete Wirtszelle eingebracht wird. Geeignete Wirtszellen sind insbesondere solche aus Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis-Oocyten und menschliche HEK293-Zellen sowie CHO-(Chinese Hamster Ovary), COS-(Afrikan Green Monkey Kidney), BHK-(Syrian Baby Hamster Kidney) und PC12-(Rat Adrenal Phenochromocytoma) – Zellen, wobei HEK293-Zellen besonders bevorzugt sind.

Das erfindungsgemäße Expressionssystem umfasst wie eingangs angegeben eine Zelle, die einen erfindungsgemäßen Rezeptor überexprimiert. Unter "überexprimieren" wird dabei jeder Vorgang verstanden, in dessen Folge der Rezeptor über das für die jeweilige Wirtszelle unter natürlichen Bedingungen maximal erreichbare Genexpressionsniveau hinausgehend vorliegt. Dabei kann der Rezeptor insbesondere auch ein für die Wirtszelle heterologer Rezeptor sein. Stellt die betreffende Wirtszelle normalerweise keinen erfindungsgemäßen Rezeptor her, so findet eine Überexpression im Sinne der Erfindung bereits dann statt, wenn sie (erstmals) überhaupt einen solchen Rezeptor herstellt. Besonders bevorzugt sind dabei solche Wirtszellen, die neben der funktionellen Expression des Rezeptors auch die für eine vom Rezeptor durch die Bindung eines Agonisten beeinflusste Signaltransduktionskaskade notwendigen Elemente bereitstellen.

Zweckmäßigerweise handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Säugerzelle, wobei die Wirtszelle insbesondere auch eine entartete Säugerzelle sein kann. Ein Beispiel hierfür ist die auf humane embryonale Nierenzellen zurückgehende Zellinie HEK293 (s. Graham et al., J. Gen. Virol. (1977): 59-72).

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Komplex angegeben, wobei der Komplex ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, sowie daran spezifisch gebunden, eine Verbindung der Formel (I) umfasst, insbesondere der Formel B oder C.

Ein solcher Komplex ist besonders vorteilhaft dazu geeignet, die Wechselwirkungen zwischen dem Rezeptor und einem Agonisten und/oder einem möglichen Antagonisten zu untersuchen. Dabei kann es sich bei dem Antagonisten um einen reversiblen oder irreversiblen handeln. Wenn der Rezeptor mit einer Signaltransduktionskaskade in Wirkverbindung steht, so ermöglicht das Herstellen eines solchen Komplexes aus Rezeptor und Agonist das Einschalten oder Aktivieren der entsprechenden Signaltransduktionskaskade. Das Herstellen eines Rezeptor-Antagonisten-Komplexes ermöglicht es in diesem Fall, das Einschalten der Signaltransduktionskaskade auch bei Vorliegen des Agonisten zu verhindern. Weitere vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten eines Komplexes aus Rezeptor und Agonist oder Antagonist sind unten beschrieben. Besonders bevorzugt sind dabei die Komplexe aus einem erfindungsgemäßen Rezeptor und einer Verbindung der Formel B3a, insbesondere mit X=CH3 (PI-23472). Diese bilden sich schon bei geringen Konzentrationen an PI-23472 Insbesondere wird gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Biosensor angegeben, umfassend

  • a) einen erfindungsgemäßen Rezeptor und
  • b) Mittel zum Nachweisen einer Bindung einer Verbindung der Formel (I) an den Rezeptor, vorzugsweise einer Verbindung der Formel B oder C, insbesondere der Formel B3a und insbesondere bevorzugt PI-23472.

Der Fachmann kann die zum Nachweisen der Bindung des Agonisten, insbesondere einer Verbindung der Formel (I) und insbesondere der Formel B oder C und insbesondere von PI-23472, an den Rezeptor geeigneten Mittel je nach der Art des gewählten Rezeptors leicht auswählen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Biosensor eine Zelle, die einen erfindungsgemäßen Rezeptor exprimiert, also a) einen OR10J1-Duftstoffrezeptor oder b) einen Duftstoffrezeptor mit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors oder c) ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein exprimiert, und in der der Rezeptor in Wirkverbindung mit einer Signaltransduktionskaskade steht. Durch das spezifische Binden des Agonisten an den Rezeptor wird ein Rezeptor-Agonist-Komplex wie soeben beschrieben hergestellt. Dabei kann es zu einer nicht im wesentlichen lediglich auf den Ort der Bindung des Agonisten begrenzten Konformationsänderung des Rezeptors kommen. Durch diese Konformationsänderung oder auf andere Weise löst der Rezeptor nach der Bindung des Agonisten die Signaltransduktionskaskade aus. Diese wiederum erzeugt ein messbares Signal, beispielsweise in Form einer Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration. Anstelle der cytosolischen Ca2+-Konzentration kann auch der Konzentrationsanstieg oder der Konzentrationsabfall einer anderen Substanz, insbesondere eines second messegers wie cAMP, cGMP, IP3 und dergleichen gemessen werden. Der Fachmann kann anhand der vom Rezeptor durch die spezifische Bindung eines Agonisten beeinflusste Signaltransduktionskaskade leicht eine geeignete Substanz zum Nachweisen dieser Bindung auswählen, deren Konzentration oder Konformation sich entsprechend der spezifischen Bindung des Agonisten an den Rezeptor ändert.

Ein solcher Biosensor ist insbesondere vorteilhaft dazu geeignet, weitere Rezeptoren zu suchen. Dazu wird der Fachmann zunächst ein Expressionssystem bereitstellen, in dem der vermutete Rezeptor funktionell exprimiert wird. Auf das Expressionssystem werden vermutete Agonisten appliziert und eine gegebenenfalls hierdurch ausgelöstes Signal des Biosensors gemessen. Wenn eine Substanz ein Biosensor-Signal auslöst und dieses Signal nicht auch in den natürlichen Zellen des Expressionssystems (also Zellen, die nicht zu einem Expressionssystem verändert wurden) auftritt, so wird vom Expressionssystem tatsächlich ein Rezeptor für diese Substanz exprimiert.

Ebenfalls wird erfindungsgemäß eine Sonde zum Nachweisen einer Nucleinsäure angegeben, die für einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Rezeptors codiert. Eine solche Sonde ist zweckmäßigerweise eine Nucleinsäure, insbesondere eine RNA oder eine, vorzugsweise einzelsträngige, DNA, wobei die Nucleinsäure mit einer Nucleinsäure hybridisieren kann, die für einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Rezeptors codiert. Bevorzugte Sonden besitzen die Sequenz SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4 oder eines 12–30, vorzugsweise 15–20 Aminosäuren langen Ausschnitt der Sequenzen SEQ ID NO 3 oder SEQ ID NO 4. Die Nucleinsäure ist verbunden mit einer nachweisbaren Markierung, beispielsweise mit einer Fluoreszenz-, Lumineszenz-, Farbmarkierung, einer radioaktiven Markierung oder einem Enzym, das die Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts katalysiert. Anstelle einer solchen nachweisbaren Markierung kann die Sonde auch an einen Feststoff, beispielsweise an Metallpartikel wie magnetische Beads, gekoppelt sein (gegebenenfalls über einen Linker).

In diesem Zusammenhang wird erfindungsgemäß gelehrt, eine Nucleinsäure, vorzugsweise eine Sonde wie zuvor beschrieben, zum Nachweisen einer Nucleinsäure, die für ein Fragment eines Rezeptors codiert, zu verwenden. So können zum einen weitere Rezeptoren mit gleicher oder ähnlicher Aminosäuresequenz wie der erfindungsgemäße Rezeptor gefunden werden.

Dabei wird die Sonde unter vorzugsweise stringenten Hybridisierungsbedingungen mit Nucleinsäuren einer zu untersuchenden Zelle in Kontakt gebracht, um ein Hybridisieren der Sonde an eine dieser entsprechenden Wirts-Nucleinsäure zu ermöglichen, falls eine solche entsprechende Nucleinsäure vorliegt. Je weniger stringent die Hybridisierungsbedingnungen sind, desto weniger ähnlich können die Nucleinsäuren sein, die mit der Sonde hybridisieren. Nach dem Hybridisieren werden die mit der Sonde hybridisierten Nucleinsäuren aufgereinigt und sequenziert.

Soll mit der Sonde nur die Anwesenheit von Nucleinsäuren, die für ein Fragment eines Rezeptors codieren, nachgewiesen werden, so reicht es aus, diese Nucleinsäuren – vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen – mit der Sonde in Kontakt zu bringen, um ein Hybridisieren der Sonde an die entsprechende Nucleinsäure zu ermöglichen, wenn eine solche entsprechende Nucleinsäure vorliegt. Dabei ist es zweckmäßig, wenn die Nucleinsäure, die mit der Sonde nachgewiesen werden soll, an einem festen Träger immobilisiert ist, beispielsweise in einem Gel oder auf einem Nylonfilter. In diesem Fall ist das Hybridisieren der Sonde an die nachzuweisende Nucleinsäure leicht dadurch nachweisbar, dass die Sonde – vermittelt durch die nachzuweisende Nucleinsäure – ebenfalls an den festen Träger gebunden ist und bei Durchführen eines Waschschrittes im wesentlichen nicht vom festen Träger abgewaschen wird. Dem Fachmann sind derartige Nachweisverfahren als Southern- oder Northern-Blot bekannt.

Erfindungsgemäß geeignete Primer zum Amplifizieren einer für OR10J1 codierenden Nucleinsäure besitzen die Sequenz SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO 2. Diese PCR-Primer können auch verwendet werden zum Expressionsnachweis mit Hilfe einer RT-PCR, sie können weiterhin eingesetzt werden, um PCR-Fragmente zu erzeugen, die für die Konstruktion von Expressionsvektoren benötigt werden.

Zudem wird erfindungsgemäß angegeben, einen erfindungsgemäßen Rezeptor zu verwenden zum Nachweisen und/oder spezifischen Binden einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C. Dadurch werden die oben beschriebenen Komplexe erzeugt, die die oben genannten Vorteile besitzen.

Eine besonders bevorzugte Verwendung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C besteht darin, die Geißelschlagfrequenz eines Spermiums zu beeinflussen. Es hat sich herausgestellt, dass auch Spermien Rezeptoren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung exprimieren und chemokinetische Reaktionen zeigen, die durch die Bindung einer Verbindung der Formel (I), insbesondere, ausgelöst werden können. Die Agonisten, also Verbindungen der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C und insbesondere der Formel B3a, können daher auch dazu verwendet werden, die Schwimmgeschwindigkeit von Spermien zu erhöhen. Die Zugabe eines Antagonisten zu Spermien führt dazu, dass die beschriebenen Effekte – bei gleichbleibender Agonistenkonzentration – entweder nicht oder nicht in dem sonst üblichen Maße eintreten.

Dementsprechend wird erfindungsgemäß auch ein Arzneimittel angegeben, insbesondere ein Kontrazeptivum oder empfängnisförderndes Arzneimittel, umfassend als Agonist eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C und insbesondere der Formel B3a, in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, insbesondere in einer kontrazeptiven oder empfängnisfördernden Menge. Die eine oder mehrere Verbindung(en) der Formel (I) können dabei insbesondere als pharmazeutisch verträgliches Salz der jeweiligen Verbindung der Formel (I) vorliegen. Unter einem Arzneimittel wird dabei jedes Mittel verstanden, das zur Vorbeugung, Diagnose oder zur Behandlung eines körperlichen Zustandes eines Menschen und/oder Tieres. eingesetzt wird. Arzneimittel im erfindungsgemäßen Sinne können daher insbesondere Arzneimittel gemäß § 1 des Arzneimittelgesetzes sein, aber auch Medizinprodukte gemäß § 3 des Medizinproduktegesetzes, jeweils in ihrer am 01. August 2002 geltenden Fassung. Ein solches Arzneimittel nutzt die mit der oben beschriebenen Verwendung von Agonisten und Antagonisten erzielbaren Vorteile. Neben den Agonisten und/oder dem Antagonisten umfasst das Arzneimittel zweckmäßigerweise einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Anstelle des Agonisten oder Antagonisten selbst kann das Arzneimittel auch eine Vorstufe des Agonisten bzw. Antagonisten umfassen, die im menschlichen und/oder tierischen Körper zu einem Agonist bzw. Antagonist umgesetzt wird.

Bei einem kontrazeptiv wirkenden Arzneimitteln kann es besonders zweckmäßig sein, einen Antagonisten – bevorzugt einen den Rezeptor irreversibel hemmenden Antagonisten – im oder auf dem menschlichen Körper, vorzugsweise in der Scheide, dem Uterus und/oder dem Eileiter freizusetzen, um dort gegebenenfalls vorhandenen Spermien die Orientierung hin zu einer gegebenenfalls vorhandenen Eizelle zu erschweren. Dies kann durch ein Intravaginalpräparat erfolgen, aus dem der Antagonist freigesetzt wird. Ebenfalls möglich ist es, ein Präservativ mit einem Antagonisten – wiederum bevorzugt einem irreversiblen – zu versehen, beispielsweise zu imprägnieren oder zu beschichten, so dass der Antagonist bei bestimmungsgemäßer Verwendung des Präservativs freigesetzt wird.

Bei einem empfängnisfördernden Arzneimittel kann es insbesondere vorteilhaft sein, einen oder mehrere Agonisten – gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Substanzen – im Eileiter und/oder Uterus freizusetzen, um Spermien mit einer niedrigen Geißelschlagfrequenz zu beschleunigen.

Ferner wird erfindungsgemäß ein Antagonist gegen das spezifische Binden eines Agonisten der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C zum Beeinflussen der Geruchswahrnehmungsfähigkeit eines Menschen und/oder eines Tieres verwendet. Die Verwendung eines Antagonisten ermöglicht es auf einfache Weise, die Geruchswahrnehmungsschwelle für einen oder mehrere Agonisten bei Mensch und/oder Tier anzuheben, so dass der betreffende Agonist weniger leicht gerochen wird. Dies kann insbesondere in den Fällen sinnvoll sein, in denen ein Agonist einen störenden Geruch entwickelt, jedoch nur mit unverhältnismäßig hohem Aufwand aus der Luft oder einem anderen Trägermedium entfernt werden kann.

Zudem wird erfindungsgemäß gelehrt, Verbindungen der Formel (I), insbesondere der Formel B3a und insbesondere die Verbindung PI-23472, als Antagonist gegen die Bindung eines Agonisten an den Rezeptor OR1D2 und insbesondere zum Aufheben der chemotaktischen Wirkung auf Spermien von Agonisten dieses Rezeptors, insbesondere von Bourgeonal, zu verwenden.

Zum Herstellen eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder Expressionssystems wird ein Verfahren angegeben, das die Schritte umfasst:

  • a) Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors in eine Zelle, und
  • b) Einstellen von Bedingungen, so dass der Nucleinsäureabschnitt des Vektors, der für den Rezeptor codiert, in der Zelle exprimiert wird.

Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Expressionssystem und damit den erfindungsgemäßen Rezeptor und gegebenenfalls auch einen erfindungsgemäßen Biosensor herzustellen. Der erfindungsgemäße Rezeptor kann aus den Zellen des Expressionssystems weiter aufgereinigt werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren angegeben zum Nachweisen einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C, , in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

  • a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Rezeptors, insbesondere eines OR10J1-Rezeptors, eines Duftstoffrezeptor smit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
  • b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen eine gegebenenfalls in der Probe enthaltene Verbindung der Formel (I) spezifisch an den Rezeptor bindet, und
  • c) Überprüfen, ob eine Verbindung der Formel (I) eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.

Der Rezeptor kann insbesondere in Form eines Expressionssystems bereitgestellt werden, in dem der Rezeptor in Wirkverbindung mit einer Signaltransduktionskaskade steht. In diesem Fall kann eine spezifische Bindung der Verbindung der Formel (I) an den Rezeptor durch das Einschalten der betreffenden Signaltransduktionskaskade überprüft werden, während das spezifische Binden des Antagonisten durch das Ausbleiben eines solchen Einschaltens der Signaltransduktionskaskade bei Anwesenheit einer Verbindung der Formel (I) überprüft werden kann. Ein solches Expressionssystem kann jedoch auch künstlich nachgebildet werden, indem der Rezeptor und die übrigen Bestandteile der Signaltransduktionskaskade in vitro zusammengestellt werden.

Der Rezeptor kann jedoch auch als aufgereinigtes Protein vorliegen, das an die Oberfläche eines festen Trägers, insbesondere einer Metalloberfläche, gebunden ist. In diesem Fall kann sich durch das spezifische Binden einer Verbindung der Formel (I) und/oder eines Antagonisten an den Rezeptor eine physikalische Oberflächeneigenschaft ändern. Dies kann beispielsweise die Änderung der Oberflächen-Plasmon-Resonanz sein, wie sie in einem Biacore-Verfahren bestimmt werden kann.

Ebenfalls möglich ist es, den Rezeptor und/oder eine Verbindung der Formel (I) und/oder einen Antagonisten mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu versehen und die durch die spezifische Bindung der Verbindung der Formel (I) und/oder des Antagonisten an den Rezeptor hervorgerufene Änderung der Fluoreszenz zu bestimmen.

Insbesondere kann der Rezeptor als Fusionsprotein mit einem green fluorescent protein-(GFP-)-Anteil vorliegen, so dass sich die Fluoreszenz des Fusionsproteins bzw. des GFP-Anteils des Fusionsproteins bei spezifischer Bindung einer Verbindung der Formel (I) und/oder eines Antagonisten entsprechend ändert. Dem Fachmann sind solche Untersuchungsverfahren unter der Bezeichnung "FREI-Assays" (Fluorescence resonance energy transfer assays) bekannt. Auf vergleichbare Weisekann der Rezeptor auch als Fusionsprotein mit einem Luciferase-Anteil vorliegen, so dass sich die Lumineszenz des Fusionsproteins bzw. des Luciferase-Anteils des Fusionsproteins bei spezifischer Bindung eines Agonisten und/oder eines Antagonisten ändert ("BRET-Assay").

Dabei ist insbesondere ein Verfahren zum Nachweisen des Antagonisten in einer Probe bevorzugt, das folgende Schritte umfasst:

  • a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Rezeptors, insbesondere eines OR10J1-Rezeptors, eines Duftstoffrezeptor smit einer Aminosäure-Sequenzhomologie von zumindest 70 % zur Aminosäuresequenz der Transmembrandomänen III bis VI des OR10J1-Duftstoffrezeptors oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
  • b) Inkontaktbringen des Rezeptors mit der zu untersuchenden Probe und Einstellen von Bedingungen, bei denen ein gegebenenfalls in der Probe enthaltener Antagonist spezifisch an den Rezeptor bindet,
  • c) Inkontaktbringen des Rezeptors mit einer Verbindung der Formel (I), insbesondere der Formel B oder C, um der Verbindung ein spezifisches Binden an den Rezeptor zu ermöglichen, falls kein Antagonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, und
  • d) Überprüfen, ob die Verbindung der Formel (I) und/oder ein Antagonist eine spezifische Bindung mit dem Rezeptor eingegangen ist.

Der Fachmann erkennt, dass die Schritte b) und c) gleichzeitig oder in einer beliebigen Reihenfolge nacheinander durchgeführt werden können, vorausgesetzt, dass Schritt c) vor oder gleichzeitig mit Schritt d) durchgeführt wird. Insbesondere können folgende Verfahrensausführungen zweckmäßig sein: In einer bevorzugten Ausführungsform wird zunächst der erfindungsgemäße Rezeptor bereitgestellt. Hierzu kann sich der Fachmann der Möglichkeiten bedienen, die oben für ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweisen eines Agonisten, insbesondere einer Verbindung der Formel (I), und/oder Antagonisten beschrieben wurden. Anschließend wird der Rezeptor mit der gegebenenfalls antagonistenhaltigen Probe in Kontakt gebracht. Dabei werden solche Bedingungen eingestellt, unter denen ein Antagonist spezifisch an den Rezeptor binden könnte, so er denn in der Probe vorhanden ist. Nach dem Inkontaktbringen mit dem Antagonisten wird der Rezeptor mit einem Agonisten in Kontakt gebracht. Hierbei werden die Bedingungen so eingestellt, dass der Agonist an den Rezeptor spezifisch binden kann, wenn kein Antagonist an den Rezeptor spezifisch gebunden hat. Abschließend wird überprüft, ob der Agonist an den Rezeptor spezifisch gebunden hat. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, dass das Einschalten einer Signaltransduktionskaskade überprüft wird, mit der der Rezeptor in Wirkverbindung steht. Wenn der Agonist an den Rezeptor gebunden hat, dann liegt der Antagonist wahrscheinlich nicht in einer Konzentration in der zu untersuchenden Probe vor, bei der er das spezifische Binden des Agonisten verhindern könnte. Insbesondere kann es möglich sein, das Maß der Agonistenbindung an den Rezeptor zu bestimmen und hieraus – gegebenenfalls nach einer entsprechenden Kalibrierung – auf die Konzentration des Antagonisten in der zu untersuchenden Probe zu schließen.

In einer bevorzugten Abwandlung des Verfahrens wird der Rezeptor zuerst mit dem Agonisten und anschließend mit der den Antagonisten gegebenenfalls enthaltenden Probe in Kontakt gebracht. In diesem Fall kann aus der Abnahme des Maßes, in dem der Agonist spezifisch an den Rezeptor gebunden ist, auf die Anwesenheit des Antagonisten und gegebenenfalls auch auf dessen Konzentration in der zu untersuchenden Probe geschlossen werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und der Beispiele näher erläutert, ohne dass diese den Schutzbereich der Patentansprüche einschränken sollen.

1 zeigt die spezifische Aktivierung von HEK293-Zellen durch PI-23472.

Beispiel 1: Spezifische Aktivierung von HEK293-Zellen durch PI-23472

HEK293-Zellen wurden transient mit einem Vektor transfiziert, der für OR10J1 codierte. Zum Herstellen des Vektors wurde das Gen für OR10J1 mit den Primern SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2 amplifiziert, mit der Restriktionsnuklease EcoRV verdaut und das erhaltene Fragment in die entsprechende Schnittstelle des Vektors pCDNA3 (Invitrogen, USA) kloniert.

Das verwendete Transfektionsprotokoll in diesem und den folgenden Beispielen entspricht dem der WO 2004/033496 A1, auf deren Inhalt, insbesondere auf deren Beispiele 3 bis 13, in soweit verwiesen wird.

HEK293-Zellen unter Standardbedinungen in DMEM (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbour 1982) mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und Streptomycin und 2 mM L-Glutamin gehalten. Die Transfektion erfolgte durch Calciumphosphat-Präzipitation. Etwa 1 h vor Beginn der Transfektion wurde das Medium durch 2 ml frisches DMEM ersetzt. Zur Transfektion wurden 100 bis 200 μl des Transfektionsreagens zugegeben. Nach 24 h wurden die Zellen mit frischem PBS++ (2.7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,48 mM MgCl2, pH 7,3–7,5) gewaschen und erneut mit frischem DMEM kultiviert. Zur Calcium-Darstellung wurde das DMEM drei Tage nach der Transfektion durch übliche Ringer-Lösung ausgetauscht. Als Indikator der Calcium-Konzentration wurde Fura2 (Molecular Probes) nach Anleitung des Herstellers verwendet.

1 zeigt eine repräsentative Abbildung einer Ca2+-Verteilung in den transfizierten HEK293-Zellen. HEK293-Zellen wuren mit einem Vektor transfiziert, der für OR10J1 codiert. Etwa 5% der transfizierten Zellen zeigten eine signifikante Zunahme des intrazellulären Calciumgehalts nach Zugabe von PI-23472.

Beispiel 2: Spezifität von Spermien-Duftstoffrezeptoren

HEK293-Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Vektoren transfiziert, die für OR10J1 oder OR1D2 codierten. Die transfizierten Zellen wurden auf ihre Reaktion auf verschiedene Substanzen hin untersucht.

2 zeigt in drei Teilfiguren die Entwicklung des intracellulären Ca2+-Gehalts der transfizierten HEK293-Zellen nach Verabreichen der jeweils angegebenen Substanz. Teilfigur a zeigt, dass OR10J1-transfizierte HEK293-Zellen auf die Verabreichung von PI-23472 mit einer Erhöhung des intracellulären Ca2+-Gehalts reagieren. n-Undecanal wirkt dabei nicht als Inhibitor. Ähnlich starke Erhöhungen des intracellulären Ca2+-Gehalts konnten bei OR10J1-transfizierten HEK293-Zellen auch mit den übrigen Verbindungen der Formel (I) erreicht werden (nicht dargestellt). Teilfigur b zeigt, dass OR1D2-transfizierte HEK293-Zellen auf die Verabreichung von Bourgeonal nur in Abwesenheit des Antagonisten n-Undecanal mit einer Erhöhung des intracellulären Ca2+-Gehalts reagieren. Teilfigur c zeigt, dass OR1D2-transfizierte HEK293-Zellen nicht auf die Verabreichung von PI-23472 mit einer Erhöhung des intracellulären Ca2+-Gehalts reagieren.

Beispiel 3: Beeinflussung des Verhaltens von Spermien

Die Reaktion von Spermien auf Bourgeonal und PI-23742 wurde untersucht wie in Beispiel 17 der WO 2004/033496A1 beschrieben, wobei jedoch frische Spermaproben statt gefrorener Spermaproben verwendet wurden.

Die Reaktionen von Sperma auf Bourgeonal und PI-23742 wurde (a) durch computer-assisted video motion analysis (CAVMA) gemessen, um Veränderungen in der Schwimmgeschwindigkeit (Spermaaktivierung) zu detektieren, und (b) in einem flat capillary-Assay für die Chemotaxis in der Nähe einer Diffusionsmaterialquelle untersucht. Für jede Test- oder Kontroll-Behandlung wurden fünf wiederholte Experimente unter Verwendung von Sperma der fünf Spender durchgeführt. Die Daten der Bioassays wurden statistisch durch Ein-Weg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung eines post-hoc Schelle-Tests (R. W. Day and G. P. Quinn, Ecol. Monogr. 59, 433–463 (1989)) analysiert. Eine Bonferroni-Korrektur wurde zum Angleichen der α-Levels für multiple Vergleiche verwendet.

Zur Untersuchung der Spermien-Aktivierung wurden Bioassays für die Schwimmgeschwindigkeit bei 37°C durchgeführt. Spermien wurden sanft einer Kontroll- oder Testlösung einheitlicher Konzentration zugefügt. Die Bilder von Spermien (3,0 × 103 Zellen/ml) wurden dann unter Verwendung einer Videokamera (NEC Modell TI 23A), die auf einem Olympus IX70-Lichtmikroskop montiert war, bei 90-facher Vergrößerung aufgenommen. Um mögliche Artefakte durch Reibungskräfte zu minimieren, besaß die Kamera eine 100 μm Feldtiefe und fokussierte auf eine Region, die annäherend 2 mm von der nächsten Oberfläche entfernt war. Videobilder von Spermien wurden mit 30 Bildern/Sekunde digitalisiert und über 10-Sekundenintervalle unter Verwendung eines CAVMA-Systemes (Motion Analysis Corporation, Modell VP 320, Expert Vision und Benutzter-Software), verbunden mit einer Sun SPARC 2 Computer-Arbeitsstation bearbeitet (J. A. Riffell, P. J. Krug, R. K. Zimmer, Journal of Experimental Biology 205, 1439–1450 (2002)). Die Schwimmgeschwindigkeit wurde auf einer Bild-zu-Bild-Basis bestimmt und danach über jeden einzelnen zurückgelegten Weg gemittelt. Um zu vermeiden, sich horizontal anstatt vertikal bewegende Zellen zu messen, wurden kurze Wege mit weniger als 11 Bildern verworfen, bei denen sich die Spermien um mehr als 20 % in ihrer scheinbaren Größe veränderten.

Zur Untersuchung der Spermien-Chemotaxis wurden Kammern mit vier getrennten Kompartimenten verwendet, wobei die Kapillar-Methode von Adler (J. Adler, Science 153, 708–716 (1966); J. Adler, Journal of General Microbiology 74, 77–91 (1973)) modifiziert wurde. Jedes Kompartiment bestand aus zwei durch einen Kanal verbundenen Vertiefungen. Die Spermienproben (106 Zellen/ml) wurden jeweils in den Vertiefungen vorgelegt. Ein flaches 6 μl-Mikrokapillarröhrchen (Drummond Scientific Co.), das entweder Test- oder Kontrolllösung enthielt, wurde in den Kanal eingeführt, wobei seine beiden Enden die frischen Spermien-Suspensionen innerhalb der zwei Vertiefungen berührten. Nach vier Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Inhalte jeder Kapillare in die Vertiefung eines Toxoplasmose-Objektträgers transferiert, hitzefixiert und mit 0,1 Acridin-Orange 1 Minute lang gefärbt. Zellzählungen wurden dann unter Verwendung eines Olympus-BH2-Mikroskopes, das für Phasenkontrast- und Epifluoreszenz-Applikationen ausgerüstet war (J. A. Riffell, P. J. Krug, R. K. Zimmer, Journal of Experimental Biology 205, 1439–1450 (2002); C. C. Gee and R. K. Zimmer-Faust, Journal of Experimental Biology 200, 3185–3192 (1997)), bei 67-facher Vergrößerung durchgeführt.

Zur Bestimmung der Chemoattraktion von Spermien und des Effekts eines Antagonisten wurde PI-23742 und Bourgeonal allein bzw. Bourgeonal bei 10–7 M in Kombination mit 10–6, 10–7, 10–8 oder 10–9 M PI-23742 getestet. Während der Durchführung der Chemotaxis-Bioassays wurde das Spermienverhalten innerhalb eines Bereiches von 300 μm vor jeder Kapillarspitze 30 Sekunden lang auf Video aufgenommen. Die Videoaufnahme begann 10 bis 15 Minuten nach dem Experimentbeginn, um die Bildung eines chemischen Gradienten zu ermöglichen. Die Spermien-Orientierung zum Gradienten hin wurde unter Verwendung von CAVMA quantifiziert. Durch Anwendung zirkulärer Statistiken wurde die mittlere Vektorlänge (r) und die Schwimmrichtung berechnet, um das Bewegungsmuster der untersuchten Spermien zu beschreiben. Der Winkel der Spermienorientierung wurde in Bezug auf einen Ursprung angegeben, der als die kürzeste Verbindung zwischen jeder individuellen Zelle und der Kapillarenspitze (0°) definiert wurde. Um zu bestimmen, ob die Zellbewegung innerhalb des chemischen Gradienten nicht-zufällig war, wurde jede mittlere Ausrichtung mit einer uniformen zirkulären Verteilung unter Verwendung eines unimodalen Rayleigh-Tests (J. H. Zar, Biostatistical Analysis (1984)) verglichen.

Die Spermien reagierten (vgl. 3) auf PI-12372 und Bourgeonal in einer Dosis-abhängigen Weise, indem sie erhöhte Schwimmgeschwindigkeiten und Chemotaxis in Kapillar-Assays zeigten. Die 3 stellt diese Ergebnisse graphisch dar, wobei die Werte Mittelwerte und Standartabweichung mit aus den Rohdaten berechneten Regressionsgeraden sind. Ab einer Konzentration von 10–6 erhöhte PI-23472 die Schwimmgeschwindigkeit von Spermien (Teilfigur b).

PI-23742 konnte die chemotaktische Wirkung von Bourgeonal auf Spermien hemmen (3, Teilfigur a). Dieser Befund ist konsistent mit der obigen Feststellung, dass Verbindungen der Formel (I), insbesondere der Formel B3a und insbesondere PI-23472 Antagonisten der Bourgeonalwirkung sind.

Beispiel 4: Herstellung von 1-(4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol/1-[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol1.1. 1,5,5-Trimethyl-4-(1-methylen-allyl)-cyclopenten (XI):

Zu einer Lösung aus Methyltriphenylphosphoniumbromid (708.1 g, 1.98 mol) in Diethylether (1900 ml) gibt man Kalium-tert-butanolat (222.5 g, 1.98 mol) hinzu. Die sich bildende gelbe Lösung wird nach beendeter Zugabe auf Rückflusstemperatur erhitzt und nach 60 Minuten tropft man α-Methylencampholenaldehyd ((X), 247.4 g, 1.51 mol) hinzu. Nach beendeter Reaktion lässt man auf Raumtemperatur abkühlen und gibt unter starkem rühren Pentan (600 ml) und Wasser (600 ml) hinzu. Der entstandene Niederschlag wird abgesaugt, anschließend trennt man die Phasen, und extrahiert die wässrige Phase noch dreimal mit Diethylether (je 750 ml). Die vereinigten organischen Phasen werden getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Das erhaltene Rohprodukt wird nochmals in Pentan (500 ml) aufgenommen und der sich bildende Niederschlag wird abgesaugt. Anschließend entfernt man das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer und erhält 281.6 g Rohprodukt (XI), mit einem Produktgehalt von 79%. Das erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt. Zur spektroskopischen Strukturbestimmung wird eine kleine Probe des Rohproduktes flashchromatographisch gereinigt.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 0.75 (s, 3H), 1.07 (s, 3H), 1.61 (td, J = 2.1, 1.6 Hz, 3H), 2.33 (dquin, J = 8.2, 2.1 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 4.98–5.06 (m, 2H), 5.20–5.23 (m, 1H), 5.27–5.33 (m, 1H), 5.33 (dd, J = 17.4, 1.3 Hz, 1H), 6.38 (ddd, J = 17.4, 10.8, 0.9 Hz, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 12.8, 21.4, 27.0, 34.9, 47.8, 51.0, 113.0, 114.9, 121.5, 140.4, 147.2, 147.3.

1.2 1-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cydohex-3-enyl]-ethanon/1-[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanon

Zu einer heterogenen Lösung von Aluminiumchlorid (23.79 g, 0.18 mol) in Toluol (350 ml) tropft man Methylvinylketon (124.8 g, 1.78 mol), gelöst in Toluol (75 ml), so zu, dass die Temperatur 25°C nicht übersteigt. Man lässt 30 Minuten rühren, bevor man das Dien ((XI), 264.0 g, 1.28 rot, 79% Reinheit), gelöst in Toluol (75 ml), zugibt. Jetzt erhitzt man für 24 Stunden auf 90°C. Nach beendeter Reaktion gießt man den Reaktionsansatz auf gesättigte NaHCO3-Lösung (500 ml), trennt die Phasen und wäscht die organische Phase mit gesättigter NaHCO3-Lösung bis zur Neutralität. Anschließend wird die organische Phase über Na2SO4 getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Man erhält 404.1 g Rohprodukt, wobei die beiden Isomeren (B3a) und (B3b) mit R2 = -CH3 im Verhältnis 3:1 und in einer Gesamtreinheit von 73.2% entstehen. Das erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt. Zur spektroskopischen Strukturbestimmung wird eine kleine Probe des Rohproduktes flashchromatographisch (Cyclohexan/EtOAc = 10:1, Rf = 0.24) gereinigt.

Die spektroskopischen Daten beziehen sich auf (IXa mit R1 = -CH3).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 0.73 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 1.56–1.60 (m, 3H), 1.89–2.27 (m, 7H), 2.17 (s, 3H), 2.23–2.37 (m, 1H), 2.39–2.46 (m, 1H), 2.51–2.60 (m, 1H), 5.22–5.27 (m, 1H), 5.45–5.52 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 12.7, 20.6, 25.1, 26.7, 27.2, 27.9, 28.7, 32.4, 47.5, 48.1, 57.3, 120.5, 121.2, 137.5, 146.9, 211.2.
Geruch: Schwache Sandelholznote, holzig-süß, moosig, nussig.

1.3 1-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol/1-[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol

Zu einer auf 0°C abgekühlten Lösung des Reaktionsgemisches nach Vorschrift 1.2 (253.6 g, 0.80 mol, Reinheit 73.2%) in Ethanol (600 ml) gibt man portionsweise Natriumborhydrid (15.1 g, 0.4 mol). Nach beendeter Zugabe lässt man auf Raumtemperatur kommen und rührt eine weitere Stunde. Nach beendeter Reaktion gibt man 2M HCl zu, bis der Reaktionsansatz pH = 7 erreicht. Anschließend rotiert man das Ethanol ab und nimmt den Rückstand in gesättigter NaCl-Lösung (300 ml) auf. Jetzt wird dreimal mit Diethylether (je 500 ml) extrahiert, bevor man die vereinigten organischen Phasen über Na2SO4 trocknet, abfiltriert und einrotiert. Man erhält 247.1 g Rohprodukt, wobei die beiden isomere im Verhältnis 3:1 und in einer Gesamtreinheit von 76.5% entstehen. Anschließende Vakuumdestillation an einer 30 cm Füllkörperkolonne (Sdp.: 100–103°C, 0.11 mbar) liefert die gewünschten Verbindungen (im Verhältnis 3:1) in 97%-iger Reinheit.

Die beiden Regioisomere konnten durch präparative HPLC (Säule: GROM Saphir 110 Si, 5 μm, 125 × 20 mm; Eluent: Methanol/Wasser = 3:1; Flussrate: 25 ml/min; Druck: 120 bar) getrennt, analysiert, spektroskopisch vermessen und geruchlich evaluiert werden.

1-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol

  • 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 0.73 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 1.19 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.25–1.38 (m, 1H), 1.54 (s, 1H, OH), 1.43–1.60 (m, 1H), 1.59 (td, J = 2.4, 1.6 Hz, 3H), 1.68–2.12 (m, 5H), 2.12–2.22 (m, 1H), 2.25–2.36 (m, 1H), 2.43 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 3.57 (quint, J = 6.4 Hz, 1H), 5.24–5.27 (m, 1H), 5.45–5.52 (m, 1H).
    13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 12.8, 20.7, 20.8, 25.1, 26.8, 28.1, 29.5, 32.5, 41.5, 48.2, 57.6, 71.9, 121.5, 121.6, 137.8, 147.4.
    Geruch: sehr intensive Sandelholznote, natürlich an β-Santalol erinnernd, etwas milchig-fettig mit schwachem Moschuscharakter, enorme Raumwirkung (Diffusivität) und Haftung (Substantivität).

1-[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-ethanol

  • 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 0.74 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 1.20 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.25–1.38 (m, 1H), 1.46–1.58 (m, 1H), 1.58–1.61 (m, 3H), 1.64–1.76 (m, 1H), 1.78–.96 (m, 2H), 2.02–2.22 (m, 4H), 2.26–2.38 (m, 4H), 2.40–2.48 (m, 1H), 3.61 (quint, J = 6.4 Hz, 1H), 5.24–5.28 (m, 1H), 5.46–5.53 (m, 1H).
    13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 12.8, 20.7, 20.8, 24.4, 25.6, 26.9, 32.1, 32.5, 41.8, 48.2, 57.8, 71.7, 121.6, 122.5, 137.0, 147.4.
    Geruch: Weiche Sandelholznote, trocken, etwas staubig.

Beispiel 5: Herstellung von 2-[4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-propan-2-ol/2-[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-propan-2-ol

Zu einer 3M Methylmagnesiumchlorid-Lösung in THF (15 ml, 45 mmol) tropft man (B3a)/(B3b) = 3:1 mit R2 = -CH3 (8.21 g, 35 mmol), gelöst in Diethylether (10 ml), so zu, dass die Temperatur 35°C nicht übersteigt. Nach beendetem zutropfen rührt man noch 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion gießt man die Reaktionslösung auf kalte NH4Cl-Lösung (15 ml), trennt die Phasen und extrahiert die wässrige Phase noch zweimal mit Diethylether (je 50 ml). Die vereinigten organischen Phasen werden noch je einmal mit gesättigter NaHCO3-Lösung und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, bevor sie über Na2SO4 getrocknet, abfiltriert und einrotiert werden. Man erhält 9.52 g Rohprodukt, welches durch Flashchromatographie (Cyclohexan/EtOAc = 10:1, Rf = 0.21) gereinigt wird. Die spektroskopischen Daten beziehen sich auf Verbindung (C2a) mit R4 = -CH3.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 0.75 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 1.18–1.30 (m, 1H), 1.47–1.60 (m, 1H), 1.60 (td, J = 2.3, 1.7 Hz, 3H), 1.80–2.05 (m, 3H), 2.05–2.23 (m, 4H), 2.23–2.38 (m, 1H), 2.43 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 5.23–5.28 (m, 1H), 5.46–5.53 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 12.7, 20.6, 24.1, 26.1, 26.8, 27.0, 27.1, 27.3, 30.4, 32.4, 45.2, 57.4, 72.5, 121.3, 121.6, 137.5, 147.1.
Geruch: Schwache Sandelholznote, etwas fettig.

Beispiel 6: Herstellung von [4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-methanol/[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cycfohex-3-enyl]-methanol3.1 4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-encarbaldehyd/3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-encarbaldehyd

Zu einer heterogenen Lösung von Aluminiumchlorid (12.11 g, 91.00 mmol) in Toluol (700 ml) tropft man Acrolein (47.85 g, 0.85 mol), gelöst in Toluol (275 ml), so zu, dass die Temperatur 25°C nicht übersteigt. Man lässt 30 Minuten rühren, bevor man das Dien ((XI), 143.8 g, 0.70 mol, 79% Reinheit), gelöst in Toluol (45 ml), zugibt. Jetzt erhitzt man für 24 Stunden auf 90°C. Nach beendeter Reaktion gießt man den Reaktionsansatz auf gesättigte NaHCO3-Lösung (300 ml), trennt die Phasen und wäscht die organische Phase mit gesättigter NaHCO3-Lösung bis zur Neutralität. Anschließend wird die organische Phase über Na2SO4 getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Man erhält 195.4 g Rohprodukt, wobei die beiden Isomeren (B3a) und (B3b) mit R2 = H im Verhältnis 3:1 und in einer Gesamtreinheit von 66.5% entstehen. Das erhaltene Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt. Zur spektroskopischen Strukturbestimmung wird eine kleine Probe des Rohproduktes flashchromatographisch (Cyclohexan/EtOAc = 10:1, Rf = 0.22) gereinigt.

Die Massenspektroskopischen Daten beziehen sich auf (B3a mit R2 = H).
MS: m/z (%) = 41 (C3H5+, 82), 55 (C4H7+, 43), 67 (C5H7+, 43), 79 (C6H7+, 75), 91 (C7H7+, 100), 105 (C8H9+, 67), 119 (C9H11+, 60), 148 (M+ – C4H6O, 56), 175 (M+ – C3H7+, 73), 203 (M+ – CH3), 218 (M+, 35).
Geruch: Intensive Sandelholznote, schöne Natürlichkeit.

3.2 [4-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cyclohex-3-enyl]-methanol/[3-(2,2,3-Trimethyl-cyclopent-3-enyl)-cycfohex-3-enyl]-methanol

Zu einer Suspension aus Lithiumaluminiumhydrid (10.16 g, 0.27 mol) in Diethylether (400 ml) tropft man die Mischung der Aldehyde (B3a/B3b = 3:1, mit R2 R = H, 178.0 g, 0.54 mol, 66.5% Reinheit, aus Beispiel 3.1), gelöst in Diethylether (150 ml), so zu, dass der Diethylether leicht siedet. Nach beendeter Zugabe lässt man noch 30 Minuten rühren, bevor man nacheinander n-Hexan (150 ml), Wasser (150 ml) und 15%ige NaOH (100 ml) zugibt. Der enstandene Niederschlag wird abgesaugt, die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird noch dreimal mit Diethylether (je 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Na2SO4 getrocknet, abfiltriert und einrotiert. Man erhält 151.8 g Rohprodukt in 68%-iger Reinheit. Anschließende Vakuumdestillation an einer 30 cm Füllkörperkolonne (Sdp.: 92–94°C, 0.07 mbar) liefert die gewünschte Verbindung (C1a/C1b = 3:1, mit R4 = H) in 98%-iger Reinheit.

Die spektroskopischen Daten beziehen sich auf (C1a mit R4 = H).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 0.74 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 1.18–1.38 (m, 2H), 1.59 (td, J = 2.2, 1.6 Hz, 3H), 1.72–1.86 (m, 3H), 1.91–2.05 (m, 1H), 2.06–2.22 (m, 3H), 2.25–2.37 (m, 1H), 2.43 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 3.49–3.59 (m, 2H), 5.24–5.28 (m, 1H), 5.46–5.50 (m, 1H).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 12.7, 20.7, 25.9,26.9, 27.7, 28.9, 32.5, 36.6, 48.2, 57.6, 67.8, 121.5, 121.6, 138.1, 147.3.
Geruch: Schöne Sandelholznote mit Moschusaspekten.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.