Title:
New nucleic acid useful as immuno-stimulating adjuvant for manufacture of a composition for treatment of cancer diseases e.g. colon carcinomas and infectious diseases e.g. influenza and malaria
Kind Code:
A1


Abstract:
Nucleic acid (I) is new. Nucleic acid of formula G lX mG n (I) is new. G = guanosine, uracil or an analog; X = guanosine, uracil, adenosine, thymidine, cytosine or an analog; l = 1-40; m >= 3; and n = 1-40. Provided that: (a) when l = 1 than G is guanosine or an analog; (b) when l > 1 than at least 50% of the nucleotides are guanosine or an analog; (c) when m = 3 than X is uracil or an analog; (d) when m > 3 than X carries at least 3 successive uracils or analogs; (e) when n = 1 than G is guanosine or an analog; (f) when n > 1 than at least 50% of the nucleotides are guanosine or an analog. ACTIVITY : Immunostimulant; Antimicrobial; Cytostatic; Virucide; Antimalarial; Respiratory-Gen; Anti-HIV; Antibacterial; Protozoacide; Neuroprotective; Dermatological; Antiinflammatory; Immunosuppressive; Anti-Abortive; Gastrointestinal-Gen; Vulnerary; Gynecological; Osteopathic; Antileprotic; Auditory; Antiarthritic; Ophthalmological; Uropathic; Antitubercular; Tuberculostatic; Antiparasitic; Fungicide; Schistosomacide; Anthelmintic. MECHANISM OF ACTION : None given.



Inventors:
Hoerr, Ingmar, Dr. (Tübingen, 72070, DE)
Probst, Jochen, Dr. (Deizisau, 73779, DE)
Ketterer, Thomas, Dr. (Tübingen, 72070, DE)
Scheel, Birgit, Dr. (Tübingen, 72076, DE)
Application Number:
DE102006035618
Publication Date:
02/07/2008
Filing Date:
07/31/2006
Assignee:
CureVac GmbH (Tübingen, 72076, DE)
Domestic Patent References:
DE69819150T2N/A2004-07-22



Foreign References:
200501309182005-06-16
EP13748942004-01-02
EP07726192006-06-07
Other References:
Medline Abstract AN 2003040716 [Vaccine, 2003,
Vol. 212 (9-10), 990-995];
Attorney, Agent or Firm:
Bosch, Graf von Stosch, Jehle Patentanwaltsgesellschaft mbH (München, 80639)
Claims:
1. Nukleinsäure der Formel (I): GlXmGn, wobei:
G Guanosin, Uracil oder ein Analogon ist;
X Guanosin, Uracil, Adenosin, Thymidin, Cytosin oder ein Analogon davon ist;
l eine ganzzahlige Zahl zwischen 1 und 40 ist,
wobei bei l = 1 G = Guanosin oder ein Analogon davon ist,
bei l > 1 mindestens 50% der Nukleotide Guanosin oder ein Analogon davon sind;
m eine ganzzahlige Zahl und mindestens 3 ist;
wobei bei m = 3 X = Uracil oder ein Analogon davon ist,
bei m > 3 mindestens 3 aufeinanderfolgende Uracile oder Analoga davon auftreten;
n eine ganzzahlige Zahl zwischen 1 und 40 ist,
wobei bei n = 1 G = Guanosin oder ein Analogon davon ist,
bei n > 1 mindestens 50% der Nukleotide Guanosin oder ein Analogon davon sind.

2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Länge von etwa 5 bis 100 Nukleotiden aufweist.

3. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure der Formel (I) als RNA oder DNA, einschließlich einer cDNA, einzelsträngig oder doppelsträngig, als Homo- oder -Heteroduplex und linear oder zirkulär vorliegt.

4. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure der Formel (I) als einzelsträngige RNA vorliegt.

5. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure der Formel (I) mindestens eine Sequenz enthält ausgewählt aus den folgenden Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1–77:

6. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Nukleotid der Nukleinsäure der Formel (I) chemisch modifiziert ist.

7. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure der Formel (I) als RNA vorliegt und zusätzlich am 5'-Ende eine "Cap-Struktur" und/oder am 3'-Ende einen Poly-A-Schwanz aufweist.

8. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure der Formel (I) eine Lipid-Modifizierung aufweist.

9. Nukleinsäure gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipid-modifizierte Nukleinsäure aus einer Nukleinsäure der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, mindestens einem mit dieser Nukleinsäure kovalent verknüpften Linker und einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid besteht.

10. Nukleinsäure gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipid-modifizierte Nukleinsäure aus einer mindestens einer Nukleinsäure der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, und mindestens einem mit dieser Nukleinsäure kovalent verknüpften (bifunktionellen) Lipid besteht.

11. Nukleinsäure gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipid-modifizierte Nukleinsäure aus einer Nukleinsäure der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, mindestens einem mit dieser Nukleinsäure kovalent verknüpften Linker und einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid sowie mindestens einem mit dieser Nukleinsäure kovalent verknüpften (bifunktionellen) Lipid besteht.

12. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipid-modifizierte Nukleinsäure mindestens 3–8 Lipide pro Nukleinsäure aufweist, wobei
a) alle Lipide über einen Linker kovalent mit der Nukleinsäure verknüpft sind;
b) alle Lipide direkt kovalent mit der Nukleinsäure verknüpft sind;
c) ein Teil der Lipide über einen Linker kovalent mit der Nukleinsäure verknüpft sind und ein Teil der Lipide direkt kovalent mit der Nukleinsäure verknüpft sind.

13. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid ausgewählt wird aus Lipiden oder lipophilen Resten umfassend Vitamine, einschließlich α-Tocopherol (Vitamin E), RRR-α-Tocopherol (D-α-Tocopherol), L-α-Tocopherol, Racemat D,L-α-Tocopherol, Vitamin A und dessen Derivate, einschließlich Retinsäure, Retinol, Vitamin D und dessen Derivate, einschließlich den Ergosterol-Vorstufen von Vitamin D, Vitamin E und dessen Derivate, einschließlich Vitamin E-Succinat (VES), Vitamin K und dessen Derivate, Chinon bzw. Phytolverbindungen, Steroide einschließlich Gallensäuren, ausgewählt aus Cholinsäure, Desoxycholinsäure, Dehydrocholinsäure, oder Cortison, Digoxygenin, Testosteron, Cholesterol oder Thiocholesterol, oder Polyalkylenglykole, aliphatische Gruppen einschließlich C1-C20-Alkane, C1-C20-Alkene, oder C1-C20-Alkanolverbindungen, Dodecandiol, Hexadecanol oder Undecyl-Resten, oder Phospholipide einschließlich Phosphatidylglycerol, Diacylphosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, oder Di-hexadecyl-rac-glycerol, Sphingolipide, Cerebroside, Ganglioside, Triethylammonium 1,2-Di-O-hexadecylrac-glycero-3-H-phosphonat, Polyamine, Polyalkylenglykole, einschließlich Polyethylenglykol (PEG), Hexaethylenglykol (HEG), oder Palmitin und Palmityl-Reste, Octadecylamine oder Hexylamino-carbonyl-oxycholesterol-Reste, Wachse, Terpene, alicyklische Kohlenwasserstoffe, und gesättigte bzw. einfach- oder mehrfach ungesättigte Fettsäurereste.

14. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 9 und 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker ausgewählt wird aus einer Verbindung, die mindestens zwei, drei oder vier reaktive Gruppen aufweist, ausgewählt aus einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe und einer Alkoxygruppe.

15. Nukleinsäure gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker ausgewählt wird aus Glykol, Glycerin, Glycerinderivaten, 2-Aminobutyl-1,3-propandiol, 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivaten oder einem 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Gerüst, Pyrrolidin-Linkern bzw. Pyrrolidin enthaltenden organischen Molekülen.

16. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Verknüpfung zwischen der Nukleinsäure der Formel (I) und Lipid oder zwischen der Nukleinsäure der Formel (I) und einem mit dem Lipid verknüpften Linker am 3'- und/oder 5'-Ende der Nukleinsäure der Formel (I) stattfindet.

17. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1–16 als immunstimulierendes Adjuvanz.

18. Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1–16 als immunstimulierendes Adjuvanz, wobei das immunstimulierende Adjuvanz mit einem weiteren Adjuvanz kombiniert wird ausgewählt aus kationischen Peptiden einschließlich Polypeptiden einschließlich Protamin, Nukleolin, Spermin oder Spermidin, kationischen Polysacchariden, einschließlich Chitosan, TDM, MDP, Muramyldipeptid, Pluronics, Alaun-Lösung, Aluminiumhydroxid, ADJUMERTM (Polyphosphazen); Aluminumphosphat-Gel; Glucane aus Algen; Algammulin; Aluminumhydroxid-Gel (Alaun); stark Protein-adsorbierendes Aluminumhydroxid-Gel; niedrig-viskoses Aluminumhydroxid-Gel; AF oder SPT (Emulsion von Squalane (5%), Tween 80 (0.2%), Pluronic L121 (1.25%), Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7.4); AVRIDINETM (Propandiamin); BAY R1005TM ((N-(2-Deoxy-2-L-leucylamino-b-D-glucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoyl-amidhydroacetat); CALCITRIOLTM (1,25-Dihydroxyvitamin D3); Calciumphosphat-Gel; CAPTM (Calciumphosphat-Nanopartikel); Cholera-Holotoxin, Cholera-Toxin-A1-Protein-A-D-Fragment-Fusionsprotein, die Untereinheit B des Choleratoxins; CRL 1005 (Block Copolymer P1205); Cytokin-enthaltende Liposome; DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid); DHEA (Dehydroepiandrosteron); DMPC (Dimyristoylphosphatidylcholin); DMPG (Dimyristoylphosphatidylglycerin); DOC/Alaun-Komplex (Deoxycholinsäurenatriumsalz); Freund'sches vollständiges Adjuvanz; Freund'sches unvollständiges Adjuvanz; Gamma Inulin; Gerbu Adjuvanz (Mischung aus: i) N-Acetylglucosaminyl-(P1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin (GMDP), ii) Dimethyldioctadecylammoniumchlorid (DDA), iii) Zink-L-Prolin-Salz-Komplex (ZnPro-8); GM-CSF; GMDP (N-acetylglucosaminyl-(b1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin); Imiquimod (1-(2-Methypropyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin); ImmTherTM (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glycerindipalmitat); DRVs (Immunoliposome hergestellt aus Dehydrations-Rehyrdrations-Vesikeln); Interferon-γ; Interleukin-1β; Interleukin-2; Interleukin-7; Interleukin-12; ISCOMSTM („Immune Stimulating Complexes"); ISCOPREP 7.0.3.TM; Liposome; LOXORIBINETM (7-Allyl-8-oxoguanosin); LT Orales Adjuvanz (E. coli labiles Enterotoxin-Protoxin); Microspheren and Micropartikel jeder Zusammensetzung; MF59TM; (Squalene-Wasser-Emulsion); MONTANIDE ISA 51TM (aufgereinigtes unvollständiges Freund'sches Adjuvanz); MONTANIDE ISA 720TM (metabolisierbares Öl-Adjuvanz); MPLTM(3-Q-Desacyl-4'-monophosphoryl-lipid A); MTP-PE- und MTP-PE-Liposome ((N-Acetyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-(hydroxyphosphoryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz); MURAMETIDETM (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINETM und D-MURAPALMITINETM (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-Glycerindipalmitoyl); NAGO (Neuraminidase-galactoseoxidase); Nanospheren oder Nanopartikel jeder Zusammensetzung; NISVs (Nicht-ionische Tensid-Vehikel, „Non-Ionic Surfactant Vesicles"); PLEURANTM (β-Glucan); PLGA, PGA and PLA (Homo- und Co-Polymere von Milchsäure und Glykolsäure; Micro-/Nanospheren); PLURONIC L121TM; PMMA (Polymethylmethacrylat); PODDSTM (Oroteinoid-Microspheren); Polyethylen-Carbamat-Derivate; Poly-rA: Poly-rU (Polyadenylsäure-Polyuridylsäure-Komplex); Polysorbate 80 (Tween 80); Protein-Cochleate (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULONTM (QS-21); Quil-A (Quil-A-Saponin); S-28463 (4-Amino-otec-dimethyl-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol); SAF-1TM („Syntex Adjuvant Formulation"); Sendai Proteoliposome und Sendai-enthaltende Lipid-Matrices; Span-85 (Sorbitantrioleat); Specol (Emulstion von Marcol 52, Span 85 und Tween 85); Squalen oder Robane® (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan und 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-Tetracosahexan); Stearyltyrosin (Octadecyltyrosinhydrochlorid); Theramid® (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Aladipalmitoxypropylamid); Theronyl-MDP (TermurtideTM oder [thr1]-MDP; N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin); Ty-Partikel (Ty-VIPs oder Virus-artige Partikel); Walter-Reed-Liposome (Liposome enthaltend an Aluminiumhydroxid adsorbiertes Lipid A), und Lipopeptide, einschließlich Pam3Cys

19. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, mindestens einen Wirkstoff und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder weitere Hilfs- und Zusatzstoffe und/oder Adjuvanzien.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt wird aus Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, (therapeutisch wirksamen) niedermolekularen organischen oder anorganischen Verbindungen mit einem Molekulargewicht kleiner als 5.000, Zuckern, Antigenen, Antikörpern oder bereits im Stand der Technik bekannten Therapeutika.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Adjuvanz wie in Anspruch 18 definiert ist.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung als Vakzine vorliegt.

23. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen oder Infektionserkrankungen.

24. Verwendung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass Krebserkrankungen ausgewählt werden aus Kolonkarzinomen, Melanomen, Nierenkarzinomen, Lymphomen, akuter myeloider Leukämie (AML), akute lymphoider Leukämie (ALL), chronischer myeloider Leukämie (CML), chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL), Gastrointestinalen Tumoren, Lungenkarzinomen, Gliomen, Schilddrüsentumoren, Mammakarzinomen, Prostatatumoren, Hepatomen, diversen virus-induzierten Tumoren wie z. B. Papillomvirus-induzierten Karzinomen (z.B. Cervixkarzinome), Adenokarzinomen, Herpesviren-induzierten Tumoren (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertes B Zelllymphome), Hepatitis B-induzierten Tumoren (Hepatozellkarzinome), HTLV-1 und HTLV-2 induzierten Lymphomen, Akustikusneurinomen, Gebärmuttehalskrebs, Lungenkrebs, Rachenkrebs, Analkarzinomen, Glioblastomen, Lymphomen, Rektumkarzinomen, Astrozytomen, Hirntumoren, Magenkrebs, Retinoblastomen, Basaliomen, Hirnmetastasen, Medulloblastomen, Scheidenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hodenkrebs, Melanomen, Schilddrüsenkarzinomen, Blasenkrebs, Hodgkin-Syndrom, Meningeomen, Schneeberger Krankheit, Bronchialkarzinomen, Hypophysentumor, Mycosis fungoides, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs, Karzinoide, Neurinomen, Spinaliomen, Burkitt-Lymphomen, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymomen, Corpuskarzinomen, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphomen, Urethrakrebs, CUP-Sysndrom, Kopf-Hals-Tumoren, Oligodendrogliomen, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinomen, Osphaguskarzinomen, Warzenbeteiligung, Dünndarmtumoren, Kraniopharyngeomen, Ovarial-Karzinomen, Weichteiltumoren, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Pankreaskarzinomen, Zervixkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytomen, Gebärmutterkrebs, Lidtumor und Prostatakrebs.

25. Verwendung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass Infektionserkrankungen ausgewählt werden aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten wie AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanische Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-infektion, Pfeifersches-Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), bakteriellen Infektionskrankheiten wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis (Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Campliylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischer Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, Iungenentzündung, Meningitis, Bakterielle Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weicher Schanker und durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufene Inkektionskrankheiten wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas-Krankheit, Fußpilz, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Malaria, Onchozerkose (Flussblindheit), oder Pilzerkrankungen, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale Leishmaniose, Windeldermatitis, Schistosomiasis, Fischvergiftung (Ciguatera), Kandiose, Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), oder Schlafkrankheit, oder Infektionskrankheiten hervorgerufen durch Echinococcus, Fischbandwurm, Fuchsbandwurm, Hundebandwurm, Läuse, Rinderbandwurm, Schweinebandwurm und Zwergbandwurm.

26. Kit, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22, sowie optional eine technische Gebrauchsanweisung mit Angaben zur Verabreichung und Dosierung des immunstimulierenden Adjuvanz oder der pharmazeutischen Zusammensetzung.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure der allgemeinen Formel (I): GlXmGn, optional in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure und/oder in Kombination, insbesondere als immunstimulierendes Adjuvanz ggf. in Kombination mit weiteren Adjuvanzien. Des weiteren betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung und eine Vakzine, jeweils enthaltend ein erfindungsgemäßes immunstimulierendes Adjuvanz, mindestens einen Wirkstoff und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder weitere Hilfs- und Zusatzstoffe und/oder weitere Adjuvanzien. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sowie der erfindungsgemäßen Vakzine zur Behandlung von Infektionserkrankungen oder Krebserkrankungen. Ebenso umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen immunstimulierenden Adjuvanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebserkrankungen oder Infektionserkrankungen.

Sowohl bei der klassischen als auch bei der genetischen Vakzinierung tritt häufig das Problem auf, dass nur eine geringe und damit häufig unzureichende Immunantwort im zu therapierenden bzw. zu impfenden Organismus hervorgerufen wird. Daher werden Vakzinen oder Wirkstoffen häufig sog. Adjuvanzien beigefügt, d.h. Substanzen oder Zusammensetzungen, die eine Immunantwort, z.B. gegen ein Antigen, erhöhen und/oder gerichtet beeinflussen können. So ist bspw. bekannt, dass die Effektivität einiger injizierbarer medizinischer Wirkstoffe in signifikanter Weise dadurch verbessert werden kann, dass der Wirkstoff mit einem Adjuvanz kombiniert wird, welches in der Lage ist, die Freisetzung des Wirkstoffs in das Wirtszellsystem und gegebenenfalls die Aufnahme in die Wirtszellen zu beeinflussen. Auf diese Weise kann ein Effekt erzielt werden, der der periodischen Verabreichung vieler kleiner Dosen in regulären Intervallen vergleichbar ist. Der Begriff „Adjuvanz” bezieht sich in diesem Zusammenhang üblicherweise auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die als Bindemittel, Träger oder Hilfsstoff für Immunogene und/oder andere pharmazeutisch wirksame Verbindungen dient.

Im Stand der Technik wurden eine Reihe von Verbindungen und Zusammensetzungen als Adjuvanz vorgeschlagen, z.B. das Freund'sche Adjuvanz, Metalloxide (Aluminiumhydroxid, etc.), Alaun, anorganische Chelate oder Salze davon, verschiedene Paraffin-artige Öle, synthetisierte Harze, Alginate, Mucoide, Polysaccharid-Verbindungen, Caseinate, sowie aus Blut und/oder Blutgerinnseln isolierte Verbindungen wie z.B. Fibrin-Derivate, etc.. Derartige Adjuvanzien erzeugen jedoch zumeist unerwünschte Nebenwirkungen, bspw. sehr schmerzhafte Reizungen und Entzündungen am Ort der Applikation. Des weiteren werden auch toxische Nebenwirkungen, insbesondere Gewebsnekrosen, beobachtet. Schließlich bewirken diese bekannten Adjuvanzien in den meisten Fällen lediglich eine unzureichende Stimulation der zellulären Immunantwort, da ausschließlich B-Zellen aktiviert werden.

So wurden bspw. Alaune, Metalloxide und Chelate von Salzen mit der Erzeugung von sterilen Abszessen in Verbindung gebracht. Zudem wird in der Wissenschaftswelt bezweifelt, dass solche Verbindungen wieder vollständig ausgeschieden werden. Es wird eher angenommen, dass diese zu unerwünschten anorganischer Rückständen im Körper führen. Zwar weisen solche Verbindungen üblicherweise eine geringe Toxizität auf, jedoch besteht die Möglichkeit, dass diese durch die Zellen des reticulo-endothelialen Sytems (littorale und sinusoidale Zellen der Leber und der Milz) als Teil der unlöslichen Debris phagozytiert werden. Es gibt zudem Hinweise darauf, dass eine solche Debris schädlich auf die verschiedenen Filter-Mechanismen des Körpers, z.B. der Nieren, der Leber oder der Milz einwirken kann. Solche Rückstände stellen damit eine latente und ständig präsente Gefahrenquelle im Körper und allgemein für das Immunsystem dar.

Die als Adjuvanzien im Stand der Technik verwendeten synthetisierten Öle und Petroleum-Derivate führen ebenfalls zu nachteiligen Effekten. Diese Verbindungen sind jedoch insbesondere deshalb unerwünscht, weil sie im Körper schnell metabolisieren und in ihre aromatischen Kohlenwasserstoffverbindungen zerfallen. Von solchen aromatischen Kohlenwasserstoffverbindungen ist aber bekannt, dass sie in höchstem Maße kanzerogen wirken und/oder anderweitig, z.B. durch Intercalation in die DNA, zu irreparablen DNA-Schäden führen können. Überdies wurde festgestellt, dass solche Verbindungen ebenfalls in Zusammenhang mit der Entstehung von sterilen Abszessen stehen und selten vollständig aus dem Körper wieder entfernt werden können.

Auch aus Tieren isolierte Verbindungen, wie z.B. Gelatine, sind häufig kaum als Adjuvanz zum Zwecke der Immunstimulation geeignet. Solche Verbindungen wirken zwar üblicherweise nicht zerstörerisch auf den Wirtsorganismus oder die jeweiligen Wirtszellen ein. Diese Verbindungen wandern jedoch typischerweise zu schnell von der Injektionsstelle in den Wirtsorganismus oder in die Wirtszellen, so dass die für ein Adjuvanz üblicherweise erwünschten Eigenschaften, wie z.B. eine verzögerte Freisetzung eines ggf. zusammen mit dem Adjuvanz injizierten Wirkstoffs, etc., selten erreicht werden. Einer solchen schnellen Verteilung kann z.T. mit Gerbstoffen oder anderen (anorganischen) Verbindungen entgegengewirkt werden. Der Metabolismus solcher zusätzlicher Verbindungen sowie deren Verbleib im Körper ist jedoch nicht vollständig geklärt. Es besteht daher auch hier die begründete Annahme, dass sich diese Verbindungen in der Debris ansammeln und so die Filtrationsmechanismen, z.B. der Nieren-, Leber und/oder Milzzellen, erheblich stören. Auch kann die Eigenschaft von Gelatine, bei parenteraler Verabreichung anzuschwellen, unter in vivo-Bedingungen zu unangenehmen Nebenwirkungen, wie z.B. Schwellungen, insbesondere an der Applikationsstelle und zu Unwohlheit, führen.

Bei aus Blut und/oder Blutgerinnseln isolierten Verbindungen wie z.B. Fibrin-Derivaten, etc. wurden typischerweise immunstimulatorische Effekte festgestellt. Jedoch sind die meisten dieser Verbindungen vorliegend als Adjuvanz aufgrund ihrer (parallel zu den durchaus erwünschten immunogenen Eigenschaften auftretenden) Nebenwirkungen auf das Immunsystem ungeeignet. So werden bspw. viele dieser Verbindungen als allergen eingestuft und bewirken unter Umständen eine weit über das gewünschte Maß hinausgehende Überreaktion des Immunsystems. Diese Verbindungen sind daher aus den genannten Gründen als Adjuvanz für die Immunstimmulation ebenfalls ungeeignet.

Immunstimmulatorische Effekte können darüber hinaus auch direkt mit Nukleinsäuren als Adjuvanz erzeugt werden. So spielt z.B. DNA bei der Erzeugung von Immunantworten eine zentrale Rolle. Es ist bspw. von bakterieller DNA bekannt, dass sie aufgrund des Vorhandenseins von nicht-methylierten CG-Motiven immunstimulierend wirkt, weshalb derartige CpG-DNA als immunstimulierendes Mittel und als Adjuvanz für Vakzine vorgeschlagen wurde (vgl. US-Patent 5,663,153). Diese immunstimulierende Eigenschaft von DNA kann auch durch DNA-Oligonukleotide erreicht werden, die durch Phosphorthioat-Modifikation stabilisiert sind (US-Patent 6,239,116). Das US-Patent 6,406,705 offenbart schließlich Adjuvanz-Zusammensetzungen, welche eine synergistische Kombination aus einem CpG-Oligodesoxyribonukleotid und einem Nicht-Nukleinsäure-Adjuvanz enthalten.

Die Verwendung von DNA als Adjuvanz kann jedoch unter mehreren Gesichtspunkten weniger vorteilhaft sein. DNA wird in der Blutbahn nur relativ langsam abgebaut, so dass es bei der Verwendung von immunstimulierender (Fremd-)DNA zur Bildung von Anti-DNA-Antikörpern kommen kann, was im Tiermodell bei der Maus bestätigt wurde (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 1398–1402). Die mögliche Persistenz von (Fremd-)DNA im Organismus kann so zu einer Überaktivierung des Immunsystems führen, welche bekanntermaßen bei Mäusen in einer Splenomegalie resultiert (Montheith et al., Anticancer Drug Res. 1997, 12 (5): 421–432). Des weiteren kann (Fremd-)DNA mit dem Wirtsgenom Wechselwirken, und insbesondere durch Integration in das Wirtsgenom Mutationen hervorrufen. So kann es bspw. zu einer Insertion der eingebrachten (Fremd-)DNA in ein intaktes Gen kommen, welche eine Mutation darstellt, die die Funktion des endogenen Gens behindern oder gar vollkommen ausschalten kann. Durch solche Integrationsereignisse können einerseits für die Zelle lebenswichtige Enzymsysteme zerstört werden, andererseits besteht auch die Gefahr einer Transformation der so veränderten Zelle in einen entarteten Zustand, falls durch die Integration der (Fremd-)DNA ein für die Regulation des Zellwachstums entscheidendes Gen verändert wird. Daher kann bei bisherigen Verfahren bei der Verwendung von (Fremd-)DNA als immunstimulierendem Mittel ggf. ein Risiko der Krebsbildung nicht ausgeschlossen werden.

Vorteilhafter für die Erzeugung solcher adjuvanter Immunantworten ist daher allgemein die Verwendung von RNA als Adjuvanz, da RNA gegenüber DNA eine wesentlich geringere Halbwertszeit in vivo aufweist. Dennoch zeigten sich auch bei der Verwendung von im Stand der Technik als Adjuvanz bekannten RNA-Molekülen Beschränkungen. So weisen bisher im Stand der Technik offenbarte RNA-Sequenzen in vivo nur eine begrenzte Zellpermeabilität auf. Dies kann wiederum eine erhöhte Menge an RNA zur Immunstimulation erfordern, was, ungeachtet der erhöhten Kosten aufgrund gesteigerter zu applizierender RNA-Mengen, die Gefahr der allgemein zuvor beschriebenen zumeist unerwünschten Nebenwirkungen birgt, bspw. sehr schmerzhaften Reizungen und Entzündungen am Ort der Applikation. Auch können toxische Nebenwirkungen bei hohen Gaben des verabreichten Immunstimulanzmittels nicht ausgeschlossen werden.

Trotz der bisher gezeigten Erfolge besteht daher ein fortdauernder Bedarf sowie erhebliches Interesse an einer verbesserten Immunstimulation, insbesondere an Mitteln, die einerseits geeignet sind, eine effiziente adjuvante Immunantwort im zu therapierenden bzw. zu impfenden Patienten hervorrufen, und andererseits effektiv die Aufnahme eines optional zusätzlich enthaltenen Wirkstoffs in den Körper bzw. Körperzellen unterstützen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure der Formel (I) gelöst: GlXmGn, wobei:
G Guanosin, Uracil oder ein Analogon von Guanosin oder Uracil ist;
X Guanosin, Uracil, Adenosin, Thymidin, Cytosin oder ein Analogon der vorgenannten Nukleotide ist;
l eine ganzzahlige Zahl zwischen 1 und 40 ist,
wobei bei l = 1 G = Guanosin oder ein Analogon davon ist,
bei l > 1 mindestens 50% der Nukleotide Guanosin oder ein Analogon von Guanosin sind;
m eine ganzzahlige Zahl und mindestens 3 ist;
wobei bei m = 3 X = Uracil oder ein Analogon davon ist,
bei m > 3 mindestens 3 aufeinanderfolgende Uracile oder Analoga von Uracil auftreten;
n eine ganzzahlige Zahl zwischen 1 und 40 ist,
wobei bei n = 1 G = Guanosin oder ein Analogon von Guanosin ist,
bei n > 1 mindestens 50% der Nukleotide Guanosin oder ein Analogon von Guanosin sind.

Typischerweise handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) um relativ kurze Nukleinsäure-Moleküle. Typischerweise weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) daher eine Länge von etwa 5 bis 100, 5 bis 90, oder 5 bis 80, bevorzugt eine Länge von etwa 5 bis 70, noch bevorzugter eine Länge von etwa 8 bis 60, und am stärksten bevorzugt eine Länge von etwa 8 bis 50, weiter bevorzugt von 8 bis 30, am stärksten bevorzugt von 8 bis 20 Nukleotiden auf.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) kann eine RNA oder DNA sein (bspw. eine cDNA), sie kann einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegen, als Homo- oder -Heteroduplex und linear oder zirkulär vorliegen. Besonders bevorzugt liegt die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) als einzelsträngige RNA vor.

G in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) ist Guanosin oder Uracil oder ein Analogon davon. In diesem Zusammenhang umfassen Analoga von Guanosin oder Uracil, ohne darauf beschränkt zu sein jedes natürlich vorkommende oder nicht-natürlich vorkommende chemisch veränderte Guanosin oder Uracil, z.B. durch Acetylierung, Methylierung, Hydroxylierung, etc., einschließlich z. B. 1-Methyl-Guanosin, 2-Methyl-Guanosin, 2,2-Dimethyl-Guanosin, 7-Methyl-Guanosin, 7-Deaza-Guanosin, Dihydro-Uracil, 2-Thio-Uracil, 4-Thio-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thio-Uracil, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)-Uracil, 5-Fluoro-Uracil, 5-Bromo-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-Uracil, 5-Methyl-2-Thio-Uracil, 5-Methyl-Uracil, N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, 5-Methylaminomethyl-Uracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thio-Uracil, 5'-Methoxycarbonylmethyl-Uracil, 5-Methoxy-Uracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Pseudouracil und 1-Methyl-Pseudouracil. Die Herstellung derartiger Analoga ist einem Fachmann bspw. aus den US-Patenten 4,373,071, US 4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777, US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530 und 5,700,642 bekannt, deren Offenbarung durch Verweis hier vollumfänglich mit aufgenommen ist. Bei einer wie oben beschriebenen Analoga werden erfindungsgemäß vor allem solche Analoga bevorzugt, die die Immunogeniät der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) steigern und/oder nicht mit einer weiteren eingeführten Modifikation interferieren. Mindestens ein Analogon kann in der flankierenden Sequenz Gl und/oder Gn auftreten, ggf. können auch mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90% der Nukleotide der flankierenden Sequenzen Gl und/oder Gn als Analoga vorliegen. Bevorzugt sind l und n zwischen 1 und 20, stärker bevorzugt zwischen 1 und 10 und noch stärker bevorzugt zwischen 2 und 8.

Die Anzahl der Nukleotide G in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) wird durch l oder n festgelegt. Dabei sind l oder n unabhängig voneinander eine ganzzahlige Zahl zwischen 1 und 40, wobei bei l oder n = 1 G = Guanosin oder ein Analogon davon ist, bei l oder n > 1 mindestens 50% der Nukleotide Guanosin oder ein Analogon davon sind. Beispielsweise kann, ohne darauf beschränkt zu sein, bei l oder n = 4 Gl oder Gn z.B. ein GUGU, GGUU, UGUG, UUGG, GUUG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG oder GGGG, etc. sein; bei l oder n = 5 G, oder Gn z.B. ein GGGUU, GGUGU, GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG, GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG, oder GGGGG, etc. sein; etc.. Bevorzugt ist dabei ein an Xm der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) angrenzendes Nukleotid kein Uracil.

Der Begriff "Identität" bedeutet vorliegend, dass die Sequenzen in Bezug auf eine Referenzsequenz verglichen werden und die prozentuale Identität über deren Vergleich bestimmt wird. Um bspw. die prozentuale Identität zweier Nukleinsäuresequenzen zu bestimmen, können die Sequenzen zunächst zueinander angeordnet werden („alignment"), um nachfolgend einen Vergleich dieser Sequenzen zu ermöglichen. Hierfür können z.B. Lücken in die Sequenz der ersten Nukleinsäuresequenz eingeführt werden und die Nukleotide mit der entsprechenden Position der zweiten Nukleinsäuresequenz verglichen werden. Wenn eine Position in der ersten Nukleinsäuresequenz mit dem gleichen Nukleotid besetzt ist, wie es an einer Position in der zweiten Sequenz der Fall ist, dann sind beide Sequenzen an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Sequenzen. Wird z.B. für eine bestimmte Nukleinsäure im Vergleich zu einer Referenznukleinsäure einer definierten Länge eine spezifische Sequenzidentität angenommen, so wird diese prozentuale Identität relativ in Bezug auf diese Referenznukleinsäure angegeben. Geht man daher bspw. von einer Nukleinsäure aus, die eine Sequenzidentität von 50% zu einer 100 Nukleotide langen Referenznukleinsäure aufweist, so kann diese Nukleinsäure eine 50 Nukleotide lange Nukleinsäure darstellen, die vollkommen identisch zu einem 50 Nukleotide langen Abschnitt der Referenznukleinsäure ist. Sie kann allerdings auch eine 100 Nukleotide lange Nukleinsäure darstellen, die 50% Identität, d.h. in diesem Fall 50% identische Nukleinsäuren, mit der Referenznukleinsäure über deren gesamte Länge aufweist. Alternativ kann diese Nukleinsäure eine 200 Nukleotide lange Nukleinsäure sein, die in einem 100 Nukleotide langen Abschnitt der Nukleinsäure vollkommen identisch zu der 100 Nukleotide langen Referenznukleinsäure ist. Andere Nukleinsäuren erfüllen selbstverständlich gleichermaßen diese Kriterien.

Die Bestimmung der prozentualen Identität zweier Sequenzen kann anhand eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, jedoch nicht beschränkendes, Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen herangezogen werden kann, ist der Algorithmus von Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90: 5873–5877. Ein solcher Algorithmus ist in dem NBLAST-Programm integriert, mit dem Sequenzen identifiziert werden können, die eine gewünschte Identität zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung besitzen. Um einen Lücken-Abgleich (auch "gapped alignment"), wie oben beschrieben, zu erhalten, kann das "Gapped BLAST"-Programm verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25: 3389–3402 beschrieben. Bei der Verwendung von BLAST- und Gapped BLAST-Programmen können die Vorgabe-Parameter des jeweiligen Programms (z.B. NBLAST) verwendet werden. Die Sequenzen können weiter unter Verwendung der Version 9 von GAP (global alignment program) der "Genetic Computing Group", unter Verwendung der Vorgabe-(BLOSUM62)Matrix (Werte –4 bis +11) mit einem Strafwert für die Öffnung einer Lücke von –12 („gap open penalty", für die erste Null einer Lücke) und einem Strafwert für die Erweiterung einer Lücke von –4 (für jede zusätzliche aufeinanderfolgende Null in der Lücke) abgeglichen werden. Nach dem Abgleich (alignment) wird die prozentuale Identität dadurch berechnet, dass die Anzahl an Übereinstimmungen als Prozentanteil der Nukleinsäuren in der beanspruchten Sequenz ausgedrückt wird. Die beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der prozentualen Identität zweier Nukleinsäuresequenzen können entsprechend unter Verwendung der entsprechenden Programme auch auf Aminosäuresequenzen angewendet werden.

Ebenfalls bevorzugt sind bei l oder n > 1 mindestens 60%, 70%, 80%, 90% oder gar 100% der Nukleotide Guanosin oder ein Analogon davon, wie oben definiert. Die zu 100% verbleibenden Nukleotide (wenn Guanosin weniger als 100% der Nukleotide stellt) in den flankierenden Sequenzen Gl und/oder Gn sind Uracil oder ein Analogon davon, wie zuvor definiert. Weiterhin bevorzugt sind l oder n unabhängig voneinander eine ganzzahlige Zahl zwischen 2 und 30, stärker bevorzugt eine ganzzahlige Zahl zwischen 2 und 20 und noch stärker bevorzugt eine ganzzahlige Zahl zwischen 2 und 15. Die Untergrenze von l oder n kann, falls notwendig, variiert werden und beträgt mindestens 1, bevorzugt mindestens 2, noch stärker bevorzugt mindestens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10.

X in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) ist Guanosin, Uracil, Adenosin, Thymidin, Cytosin oder ein Analogon davon. In diesem Zusammenhang umfassen Analoga von Guanosin, Uracil, Adenosin, Thymidin, Cytosin, ohne darauf beschränkt zu sein, jedes natürlich vorkommende oder nicht-natürlich vorkommende chemisch veränderte Guanosin, Uracil, Adenosin, Thymidin oder Cytosin, z.B. durch Acetylierung, Methylierung, Hydroxylierung, etc., einschließlich 1-Methyl-Adenosin, 2-Methyl-Adenosin, 2-Methylthio-N6-isopentenyl-Adenosin, N6-Methyl-Adenosin, N6-Isopentenyl-Adenosin, 2-Thio-Cytosin, 3-Methyl-Cytosin, 4-Acetyl-Cytosin, 5-Methyl-Cytosin, 2,6-Diaminopurin, 1-Methyl-Guanosin, 2-Methyl-Guanosin, 2,2-Dimethyl-Guanosin, 7-Methyl-Guanosin, Inosin, 1-Methyl-Inosin, Dihydro-Uracil, 2-Thio-Uracil, 4-Thio-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thio-Uracil, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)-Uracil, 5-Fluoro-Uracil, 5-Bromo-Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-Uracil, 5-Methyl-2-Thio-Uracil, 5-Methyl-Uracil, N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, 5-Methylaminomethyl-Uracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thio-Uracil, 5'-Methoxycarbonylmethyl-Uracil, 5-Methoxy-Uracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Pseudouracil, 1-Methyl-Pseudouracil, Queosin, β-D-Mannosyl-Queosin, Wybutoxosin, sowie Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnukleotide, Methylphosphonate, 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin. Die Herstellung derartiger Analoga ist einem Fachmann bspw. aus den US-Patenten 4,373,071, US 4,401,796, US 4,415,732, US 4,458,066, US 4,500,707, US 4,668,777, US 4,973,679, US 5,047,524, US 5,132,418, US 5,153,319, US 5,262,530 und 5,700,642 bekannt. Bei einer wie oben beschriebenen Analoga werden erfindungsgemäß vor allem solche Analoga bevorzugt, die die Immunogeniät der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) steigern und/oder nicht mit einer weiteren eingeführten Modifikation interferieren.

Die Anzahl der X in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) wird durch m festgelegt. Dabei ist m eine ganzzahlige Zahl und typischerweise mindestens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, wobei bei m = 3 X = Uracil oder ein Analogon davon ist, und bei m > 3 mindestens 3 direkt aufeinanderfolgende Uracile oder ein Analogon davon auftreten. Eine solche Abfolge von mindestens 3 direkt aufeinanderfolgenden Uracilen wird im Zusammenhang mit dieser Anmeldung als „monotone Uracilsequenz" bezeichnet. Eine monotone Uracilsequenz weist typischerweise eine Länge von mindestens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, 10–15, 15–20, 20–25, 25–30, 30–50 oder 50–90 Uracilen oder ggf. wie oben definierten Analoga von Uracil auf. Eine solche monotone Uracilsequenz tritt dabei mindestens einmal in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) auf. Es können daher bspw. 1, 2, 3, 4, 5, oder mehr monotone Uracilsequenzen mit mindestens 3 Uracilen oder Analoga hiervon auftreten, wobei diese monotonen Uracilsequenzen durch mindestens 1 Guanosin, Adenosin, Thymidin, Cytosin oder einem Analogon davon unterbrochen sein können, bevorzugt 2, 3, 4, 5, oder mehr. Beispielsweise ist bei m = 3 Xm ein UUU. Bei m = 4 kann Xm z.B., ohne darauf beschränkt zu sein, ein UUUA, UUUG, UUUC, UUUU, AUUU, GUUU oder CUUU, etc. sein; Bei n = 10 kann Xm z.B., ohne darauf beschränkt zu sein, ein UUUAAUUUUC, UUUUGUUUUA, UUUGUUUGUU, UUGUUUUGUU, UUUUUUUUUU, etc. sein. Bevorzugt bestehen dabei die zu Gl oder Gn der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) benachbarten Nukleotide aus Uracil bzw. Analogon davon.

Typischerweise sind bei m > 3 mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80%, 90% oder gar 100% der Nukleotide Uracil oder ein Analogon davon, wie oben definiert. Die zu 100% verbleibenden (bei weniger als 100% Uracil in der Sequenz Xm) Nukleotide sind dann Guanosin, Uracil, Adenosin, Thymidin, Cytosin oder ein Analogon davon, wie oben definiert. Ebenfalls bevorzugt ist m eine ganzzahlige Zahl und mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, 10–15, 15–20, 20–25, 25–30, 30–50 oder 50–90.

Besonders bevorzugt weist die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) mindestens eine der folgenden Sequenzen der SEQ ID NO: 1–77 auf:

Bevorzugt sind erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen der Formel (I) keine natürlichen oder synthetisch hergestellten Sequenzen viralen oder bakteriellen Ursprungs.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) kann als „stabilisiertes Oligonukleotid" vorliegen, d.h. als Oligoribo- oder Oligodesoxyribonukleotid, welches resistent gegenüber in vivo – Abbau (z.B. durch eine Exo- oder Endonuklease) ist. Eine solche Stabilisierung kann z.B. durch ein modifiziertes Phosphat-Rückgrat (backbone) der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) erfolgen. In diesem Zusammenhang bevorzugt verwendete Nukleotide enthalten ein Phosphorthioat-modifiziertes Phosphat-Rückgrat (backbone), wobei bevorzugt mindestens einer der im Phosphat-Rückgrat enthaltenen Phosphat-Sauerstoffe durch ein Schwefelatom ersetzt wird. Andere stabilisierte Oligonukleotide schließen z.B. mit ein: nicht-ionische Analoga, wie z.B. Alkyl- und Aryl-Phophonate, bei welchen der geladene Phosphonat-Sauerstoff durch eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe ersetzt wird, oder Phosphodiester und Alkylphosphotriester, bei welchen der geladene Sauerstoff-Rest alkyliert vorliegt.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) kann ebenfalls stabilisiert werden. Wie zuvor ausgeführt, kann für die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) grundsätzlich jede Nukleinsäure, z.B. DNA oder RNA, verwendet werden. Unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit ist der Einsatz von RNA für eine solche Nukleinsäure jedoch bevorzugt. Insbesondere bringt RNA nicht die Gefahr mit sich, stabil in das Genom der transfizierten Zelle integriert zu werden. Darüber hinaus wird RNA wesentlich einfacher in vivo abgebaut. Ebenso wurden, wohl aufgrund der gegenüber DNA relativ kurzen Halbwertszeit von RNA im Blutkreislauf, bisher keine anti-RNA-Antikörper nachgewiesen. Im Vergleich zu DNA ist RNA in Lösung allerdings wesentlich instabiler, wofür im wesentlichen RNA-abbauende Enzyme, sog. RNAasen (Ribonukleasen), verantwortlich sind. Selbst kleinste Verunreinigungen von Ribonukleasen reichen aus, um RNA in Lösung vollständig abzubauen. Derartige RNase-Verunreinigungen können allgemein nur durch besondere Behandlungen, insbesondere mit Diethylpyrocarbonat (DEPC), beseitigt werden. Der natürliche Abbau von mRNA im Cytoplasma von Zellen ist sehr fein reguliert. Diesbezüglich sind mehrere Mechanismen im Stand der Technik bekannt. So ist für eine RNA in vivo typischerweise die endständige Struktur von entscheidender Bedeutung. Am 51 Ende natürlich auftretender RNAs befindet sich üblicherweise eine sogenannte "Cap-Struktur" (ein modifiziertes Guanosin-Nukleotid) und am 3'-Ende eine Abfolge von bis zu 200 Adenosin-Nukleotiden (der sog. Poly-A-Schwanz).

Daher kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I), falls diese als RNA vorliegt, durch Anfügung einer sog. "5'-Cap"-Struktur gegenüber dem Abbau durch RNasen stabilisiert werden. Besonders bevorzugt wird in diesem Zusammenhang einer m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A oder G(5')ppp(5')G als 5'-Cap"-Struktur. Eine solche Modifikation wird jedoch nur dann eingeführt, wenn am 5'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) nicht bereits eine Modifikation, z.B. eine Lipid-Modifikation, eingeführt wurde, bzw. wenn die Modifikation mit den immunogenen Eigenschaften der (nicht-modifizierten oder chemisch-modifizierten) erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) nicht interferiert.

Alternativ kann das 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I), falls diese als RNA vorliegt, durch eine Abfolge von mindestens 50 Adenosin-Ribonukleotiden, vorzugsweise mindestens 70 Adenosin-Ribonukleotiden, mehr bevorzugt mindestens 100 Adenosin-Ribonukleotiden, besonders bevorzugt mindestens 200 Adenosin-Ribonukleotiden modifiziert werden (sog. „PolyA-Schwanz"). Analog kann auch hier eine solche Modifikation nur dann eingeführt werden, wenn am 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) nicht bereits eine Modifikation, z.B. eine Lipid-Modifikation, eingeführt wurde, bzw. wenn die Modifikation mit den immunogenen Eigenschaften der (nicht-modifizierten oder chemisch-modifizierten) erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) nicht interferiert. Beide zuvor genannten Modifikationen, d.h. Einfügung einer "5'-Cap"-Struktur bzw. Einfügung eines „PolyA-Schwanzes" am 3'-Ende verhindern einen vorzeitigen Abbau der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) in vivo und stabilisiern damit die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) in vivo.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I), GlXmGn, eine Lipid-Modifizierung aufweisen. Eine solche erfindungsgemäße Lipid-modifizierte Nukleinsäure besteht typischerweise aus einer wie oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I), mindestens einem mit dieser erfindungsgemäßen Nukleinsäure kovalent verknüpften Linker und mindestens einem mit dem jeweiligen linker kovalent verknüpften Lipid. Alternativ besteht die erfindungsgemäße Lipid-modifizierte Nukleinsäure aus (mindestens) einer wie oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) und mindestens einem mit dieser erfindungsgemäßen Nukleinsäure (ohne Linker) kovalent verknüpften (bifunktionellen) Lipid. Gemäß einer dritten Alternative besteht die erfindungsgemäße Lipid-modifizierte Nukleinsäure aus einer wie oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I), mindestens einem mit dieser erfindungsgemäßen Nukleinsäure kovalent verknüpften Linker und mindestens einem mit dem jeweiligen Linker kovalent verknüpften Lipid sowie mindestens einem mit dieser erfindungsgemäßen Nukleinsäure (ohne Linker) kovalent verknüpften (bifunktionellen) Lipid.

Das in der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure enthaltene Lipid ist typischerweise ein Lipid oder ein lipophiler Rest, der bevorzugt an sich biologisch aktiv ist. Solche Lipide umfassen bevorzugt Naturstoffe oder Verbindungen wie z.B. Vitamine, z.B. α-Tocopherol (Vitamin E), einschließlich RRR-α-Tocopherol (früher D-α-Tocopherol), L-α-Tocopherol, dem Racemat D,L-α-Tocopherol, Vitamin E-Succinat (VES), oder Vitamin A und dessen Derivate, z.B. Retinsäure, Retinol, Vitamin D und dessen Derivate, z.B. Vitamin D sowie dessen Ergosterol-Vorstufen, Vitamin E und dessen Derivate, Vitamin K und dessen Derivate, z.B. Vitamin K und verwandte Chinon bzw. Phytolverbindungen, oder Steroide, wie Gallensäuren, bspw. Cholinsäure, Desoxycholinsäure, Dehydrocholinsäure, Cortison, Digoxygenin, Testosteron, Cholesterol oder Thiocholesterol. Weitere Lipide oder lipophile Reste im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyalkylenglykole, (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), aliphatische Gruppen wie z.B. C1-C20-Alkane, C1-C20-Alkene, oder C1-C20-Alkanolverbindungen, etc. wie bspw. Dodecandiol, Hexadecanol oder Undecyl-Reste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), Phospholipide wie z.B. Phosphatidylglycerol, Diacylphosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylchol in, Distearoylphosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Di-hexadecyl-rac-glycerol, Sphingolipide, Cerebroside, Ganglioside, oder Triethylammonium 1,2-Di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777), Polyamine oder Polyalkylenglykole, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), Hexaethylengiykol (HEG), Palmitin oder Palmityl-Reste (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229), Octadecylamine oder Hexylamino-carbonyl-oxycholesterol-Reste (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), sowie Wachse, Terpene, alicyklische Kohlenwasserstoffe, gesättigte bzw. einfach- oder mehrfach ungesättigte Fettsäurereste, etc..

Die Verknüpfung zwischen dem Lipid und der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) kann grundsätzlich an jedem Nukleotid, an der Base oder dem Zuckerrest jedes Nukleotids, am 3'- und/oder 5'-Ende, und/oder am Phosphatrückgrat der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) stattfinden. Erfindungsgemäß wird eine terminale Lipid-Modifizierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure an deren 3'- und/oder 5'-Ende besonders bevorzugt. Eine terminale Modifizierung weist gegenüber sequenzinternen Modifikationen mehrere Vorteile auf. Zum einen können sequenzinterne Modifikationen das Hybridisierungsverhalten beeinflussen, was sich ggf. bei sterisch anspruchsvollen Resten negativ auswirkt. Andererseits kann bei einer synthetischen Herstellung einer erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure, die ausschließlich terminal modifiziert ist, die Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) mit handelsüblichen, in großer Menge verfügbaren, Monomeren durchgeführt und im Stand der Technik bekannte Syntheseprotokolle verwendet werden.

Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verknüpfung zwischen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und mindestens einem verwendeten Lipid über einen (kovalent mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verknüpften) „Linker". Linker im Sinne der vorliegenden Erfindung weisen typischerweise mindestens zwei und optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10–20, 20–30 oder mehr reaktive Gruppen auf, jeweils ausgewählt aus z.B. einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe, einer Alkoxygruppe, etc.. Bevorzugt dient eine reaktive Gruppe zur Bindung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I), z.B. eines RNA-Oligonukleotids. Diese reaktive Gruppe kann in einer geschützten Form vorliegen, z.B. als DMT-Gruppe (Dimethoxytritylchlorid), als Fmoc-Gruppe, als MMT(Monomethoxytrityl-)-Gruppe, als TFA(Trifluoressigsäure)-Gruppe, etc. Weiterhin können Schwefelgruppen durch Disulfide, z.B. Alkylthiole wie bspw. 3-Thiopropanol, oder mit aktivierten Komponenten wie 2-Thiopyridin geschützt werden. Eine oder mehrere weitere reaktive Gruppen dienen erfindungsgemäß zur kovalenten Bindung eines oder mehrerer Lipide. Eine erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) kann daher gemäß der ersten Ausführungsform über den kovalent gebundenen Linker bevorzugt mindestens ein Lipid binden, z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 5–10, 10–20, 20–30 oder mehr Lipid(e), besonders bevorzugt mindestens 3–8 oder mehr Lipid(e) pro erfindungsgemäßer Nukleinsäure der Formel (I). Die gebundenen Lipide können dabei getrennt voneinander an verschiedene Positionen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) gebunden werden, aber auch als Komplex an einer oder mehreren Positionen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) vorliegen. Eine zusätzliche reaktive Gruppe des Linkers kann zur direkten oder indirekten (spaltbaren) Bindung an ein Trägermaterial, z.B. eine Festphase, verwendet werden. Bevorzugte Linker gemäß der vorliegenden Erfindung sind z.B. Glykol, Glycerin sowie Glycerinderivate, 2-Aminobutyl-1,3-propandiol sowie 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivate/Gerüst, Pyrrolidin-Linker bzw. Pyrrolidin enthaltende organische Moleküle (insbesondere für eine Modifikation am 3'-Ende), etc.. Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß als Linker Glycerin oder Glycerinderivate (C3-Anker) oder ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Derivat/Gerüst (C7-Anker) verwendet. Ein Glycerinderivat (C3-Anker) als Linker wird insbesondere dann bevorzugt, wenn die Lipid-Modifikation über eine Etherbindung eingeführt werden kann. Soll die Lipid-Modifikation z.B. über eine Amid- oder eine Urethanbindung eingeführt werden, wird z.B. ein 2-Aminobutyl-1,3-propandiol-Gerüst (C7-Anker) bevorzugt. In diesem Zusammenhang ist die zwischen dem Linker und der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) entstehende Bindung bevorzugt so beschaffen, dass sie mit den Bedingungen und Chemikalien der Amiditchemie kompatibel ist, das heißt sie ist bevorzugt weder säure- noch basenlabil. Insbesondere werden solche Bindungen bevorzugt, die synthetisch leicht zugänglich sind, und nicht durch die ammoniakalische Abspaltprozedur eines Nukleinsäuresyntheseverfahrens hydrolysiert werden. Als Bindungen kommen grundsätzlich alle entsprechend geeigneten Bindungen in Frage, bevorzugt Esterbindungen, Amidbindungen, Urethan- sowie Etherbindungen. Neben der guten Zugänglichkeit der Edukte (wenige Synthesestufen) ist dabei die Etherbindung aufgrund ihrer relativ hohen biologischen Stabilität gegenüber enzymatischer Hydrolyse besonders bevorzugt.

Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verknüpfung (mindestens einer) der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) direkt mit mindestens einem wie oben beschriebenen (bifunktionellen) Lipid, d.h. ohne Verwendung eines wie oben beschriebenen Linkers. In diesem Fall weist das erfindungsgemäß verwendete (bifunktionelle) Lipid bevorzugt mindestens zwei reaktive Gruppen, oder optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, oder mehr reaktive Gruppen, auf, wobei eine erste reaktive Gruppe zur direkten oder indirekten Bindung des Lipids an ein hier beschriebenes Trägermaterial und mindestens eine weitere reaktive Gruppe zur Bindung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) dient. Gemäß der zweiten Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) daher bevorzugt mindestens ein Lipid (direkt ohne Linker) binden, z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 5–10, 10–20, 20–30 oder mehr Lipid(e), besonders bevorzugt mindestens 3–8 oder mehr Lipid(e) pro erfindungsgemäßer Nukleinsäure der Formel (I). Die gebundenen Lipide können dabei getrennt voneinander an verschiedene Positionen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) gebunden werden, aber auch als Komplex an einer oder mehreren Positionen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) vorliegen. Alternativ kann gemäß der zweiten Ausführungsform an ein wie zuvor beschriebenes Lipid über dessen reaktive Gruppen mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) gebunden werden, z.B. optional 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10–20, 20–30 oder mehr erfindungsgemäße Nukleinsäuren der Formel (I). Besonders bevorzugt umfassen für diese zweite Ausführungsform verwendbare Lipide solche (bifunktionellen) Lipide, die (bevorzugt an ihren Termini oder optional intramolekular) eine Kopplung ermöglichen, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) sowie Derivate davon, Hexaethylenglykol (HEG) sowie Derivate davon, Alkandiole, Aminoalkan, Thioalkanole, etc.. Die Bindung zwischen einem (bifunktionellen) Lipid und einer wie zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) ist bevorzugt so beschaffen, wie für die erste bevorzugte Ausführungsform beschrieben.

Gemäß einer dritten Ausführungsform kann die Verknüpfung zwischen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) und mindestens einem wie oben beschriebenen Lipid über beide der zuvor genannten Ausführungsformen gleichzeitig erfolgen. So kann z.B. die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) an einer Position der Nukleinsäure mit mindestens einem Lipid über einen Linker verknüpft sein (analog 1. Ausführungsform) und an einer anderen Position der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) direkt mit mindestens einem Lipid ohne Verwendung eines Linkers (analog 2. Ausführungsform). Beispielsweise kann am 3'-Ende einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) mindestens ein wie oben beschriebenes Lipid über einen Linker mit der Nukleinsäure kovalent verknüpft werden und am 5'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ein wie oben beschriebenen Lipid ohne einen Linker mit der Nukleinsäure kovalent verknüpft werden. Alternativ kann am 5'-Ende einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) mindestens ein wie oben beschriebenes Lipid über einen Linker mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) kovalent verknüpft werden und am 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) ein wie oben beschriebenen Lipid ohne einen Linker mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) kovalent verknüpft werden. Ebenso können kovalente Verknüpfungen nicht nur an den Termini der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) sondern auch intramolekular stattfinden, wie zuvor beschrieben, z.B. am 3'-Ende und intramolekular, am 5'-Ende und intramolekular, am 3'- und 5'-Ende und intramolekular, ausschließlich intramolekular, etc..

Bevorzugt kann die erfindungsgemäße Lipid-modifizierte Nukleinsäure der Formel (I) durch verschiedene Verfahren erhalten werden. Die Lipid-Modifikation kann dabei grundsätzlich – wie oben definiert – an jeder Position der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) eingeführt werden, z.B. an den 3'- und/oder 5'-Enden oder am Phosphatrückgrat der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) und/oder an jeder Base bzw. am Zucker jedes Nukleotids der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I). Erfindungsgemäß werden terminale Lipid-Modifikationen an den 3'- und/oder 5'-Enden der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I) bevorzugt. Durch eine solche terminale chemische Modifizierung kann erfindungsgemäß eine große Zahl verschieden derivatisierter Nukleinsäuren erhalten werden. Beispielhafte und erfindungsgemäß mit umfasste Varianten sind in 1 gezeigt. Das Verfahren zur Herstellung solcher erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäuren der Formel (I) wird bevorzugt in Abhängigkeit der Position der Lipid-Modifizierung ausgewählt.

Findet bspw. die Lipid-Modifikation am 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) statt, so erfolgt die Lipid-Modifikation typischerweise entweder vor oder nach Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I). Die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) kann dabei über eine direkte Synthese der Nukleinsäure oder ggf. über Zugabe einer bereits fertig synthetisierten oder aus Proben von aus anderen Quellen isolierten Nukleinsäuren durchgeführt werden.

Gemäß einer ersten Alternative wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) vor der Einführung des Lipids direkt synthetisiert, typischerweise über im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Synthese von Nukleinsäuren. Dazu wird bevorzugt ein Startnukleosid, z.B. über ein Kopplungsmolekül, z.B. ein Succinylrest, an eine Festphase gebunden sowie die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I), z.B. nach dem Verfahren der Amiditchemie, synthetisiert. Anschließend wird ein wie zuvor beschriebener Linker bevorzugt über eine erste reaktive Gruppe des Linkers kovalent an das 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) gebunden. Über eine zweite reaktive Gruppe des Linkers kann danach ein wie zuvor beschriebenes Lipid kovalent mit dem Linker verknüpft werden. Alternativ kann der Linker bereits vor der Bindung an das 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) mit dem Lipid kovalent verknüpft sein. In diesem Fall ist nur die Bindung einer ersten reaktiven Gruppe des Linkers mit dem 3'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) erforderlich. Nach Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) bzw. nach Bindung des Lipids kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) von der Festphase abgespalten und entschützt werden. Falls die Synthese in Lösung durchgeführt wurde, kann nach der Synthese der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure (und ggf. vor der Abspaltung von dem Trägermaterial) ein Wasch- und Aufreinigungsschritt zur Entfernung nicht umgesetzter Recktanten sowie von Lösungsmitteln und unerwünschten Nebenprodukten durchgeführt werden.

Gemäß einer weiteren Alternative wird eine wie oben definierte erfindungsgemäße 3'-Lipid-modifizierte Nukleinsäure der Formel (I) nach der Einführung des Lipids an eine reaktive Gruppe des Linkers synthetisiert oder als fertig synthetisierte oder aus Proben isolierte Nukleinsäure der Formel (I) an die reaktive Gruppe des Linkers gebunden (siehe z.B. 5). Dazu kann z.B. eine erste reaktive Gruppe eines wie oben beschriebenen Linkers mit einem wie zuvor beschriebenen Lipid umgesetzt werden. Danach wird bevorzugt in einem zweiten Schritt eine zweite reaktive Gruppe des Linkers mit einer säurestabilen Schutzgruppe versehen, z.B. DMT, Fmoc, etc., um eine spätere Bindung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) an diese reaktive Gruppe zu ermöglichen. Danach kann über eine dritte reaktive Gruppe des Linkers der Linker direkt oder indirekt an eine Festphase gebunden werden. Eine indirekte Bindung ist z.B. über ein (Kopplungs)Molekül möglich, das sich sowohl kovalent an den Linker wie auch an die Festphase binden lässt. Ein solches (Kopplungs-)Molekül ist z.B. ein Succinylrest, etc. wie hier im folgenden beschrieben. Anschließend erfolgt üblicherweise die Entfernung der Schutzgruppe an der dritten reaktiven Gruppe des Linkers sowie die Bindung oder Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) an der nun zugänglichen reaktiven Gruppe. Abschließend erfolgt typischerweise die Abspaltung der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure vom Trägermaterial (und ggf. die Entfernung der Schutzgruppen an der Nukleinsäure). Optional kann jedoch auch an das 3'-Ende der gekoppelten erfindungsgemäßen Nukleinsäure ein weiteres Lipid gekoppelt werden, bevorzugt gemäß einem der zuvor beschriebenen Schritte.

Entsprechend einer Variante dieser vorgenannten Alternative kann ein wie oben beschriebener Linker über eine erste reaktive Gruppe direkt oder indirekt an eine Festphase gebunden werden. An eine zweite reaktive Gruppe des Linkers wird dann zunächst eine säurestabile Schutzgruppe gebunden. Nach Bindung der Schutzgruppe an die zweite reaktive Gruppe kann an eine dritte reaktive Gruppe des Linkers zunächst ein wie oben beschriebenes Lipid gebunden werden. Anschließend erfolgt ebenfalls bevorzugt die Entfernung der Schutzgruppe an der dritten reaktiven Gruppe des Linkers, die Bindung oder Synthese einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) an der nun zugänglichen reaktiven Gruppe sowie die Abspaltung der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure vom Trägermaterial (und ggf. die Entfernung der Schutzgruppen an der Nukleinsäure).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der 3'-Lipid-Modifizierung einer wie oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) kann eine solche erfindungsgemäße Lipid-modifizierte Nukleinsäure über einen Linker mit drei reaktiven Gruppen (eine trifunktionelle Ankerverbindung) auf Basis eines Glycerin-Grundkörpers (C3-Anker) sowie mit einem monofunktionellen Lipid, wie z.B. einem Palmitylrest, Cholesterol oder Tocopherol, synthetisiert werden. Als Ausgangsstoff für die Synthese des Linkers kann z.B. α,β-Isopropyliden-Glycerin (ein Glycerin enthaltend eine Ketalschutzgruppe) eingesetzt werden, das bevorzugt zunächst mit Natriumhydrid in das Alkoholat überführt und mit Hexadecylbromid und einem Lipid in einer Williamson-Synthese zum entsprechenden Ether umgesetzt wird. Alternativ kann die Etherbindung in der ersten Stufe mit einer anderen Methode geknüpft werden, z.B. durch Bildung eines Tosylats des α,β-Isopropyliden-Glycerins, und der Umsetzung des Tosylats mit der reaktiven Gruppe eines Lipids, z.B. einem acidischen Proton, zum entsprechenden Ether. In einer zweiten Stufe kann die Ketal-Schutzgruppe mit einer Säure, z.B. Essigsäure, verdünnte Salzsäure, etc. entfernt und anschließend die primäre Hydroxygruppe des Diols selektiv durch Dimethoxytritylchlorid (DMT-Cl) geschützt werden. In der letzten Stufe erfolgt bevorzugt die Umsetzung des aus dem vorangegangenen Schritt erhaltenen Produkts mit Bernsteinsäureanhydrid zum Succinat mit DMAP als Katalysator. Ein solcher Linker ist z.B. zur Bindung von Palmitylresten oder Tocopherol als Lipid besonders geeignet (siehe z.B. 5).

Nach einer anderen Alternative erfolgt die 3'-Lipid-Modifizierung einer wie oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) über Verwendung eines (bifunktionellen) Lipids, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) oder Hexaethylenglykol (HEG), ohne einen wie oben beschriebenen Linker zu verwenden. Solche bifunktionellen Lipide weisen typischerweise zwei wie oben beschriebene funktionelle Gruppen auf, wobei bevorzugt ein Ende des bifunktionellen Lipids über ein (Kopplungs-)Molekül, z.B. einen basenlabilen Succinylanker, etc. wie hier beschrieben, an das Trägermaterial gebunden werden kann und auf das andere Ende des bifunktionellen Lipids die erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) aufsynthetisiert werden kann (E. Bayer, M. Maier, K. Bleicher, H.-J. Gaus Z. Naturforsch. 50b (1995) 671). Durch das Wegfallen der dritten Funktionalisierung bzw. eines wie zuvor verwendeten Linkers vereinfacht sich die Synthese einer solchen erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure (siehe z.B. 6). Zur Herstellung wird typischerweise das erfindungsgemäß verwendete bifunktionelle Lipid, z.B. Polyethylenglykol, zunächst mit einer Schutzgruppe, z.B. DMT, monosubstituiert. In einer zweiten Stufe erfolgt üblicherweise eine Veresterung des an einer reaktiven Gruppe geschützen Lipids mit Bernsteinsäureanhydrid unter Katalyse von DMAP zum Succinat. Danach kann in einer dritten Stufe das bifunktionelle Lipid an ein Trägermaterial gekoppelt und entschützt werden, worauf in einem vierten Schritt die Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) nach einem wie zuvor beschriebenen Verfahren erfolgt. Optional erfolgt danach die Entschützung der synthetisiserten erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) sowie die Abspaltung der Lipid-modifizierten Nukleinsäure vom Trägermaterial.

Entsprechend einer anderen bevorzugten Ausführungsform findet die Lipid-Modifikation einer wie oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) am 5'-Ende der Nukleinsäure statt. Dabei erfolgt die Lipid-Modifikation typischerweise entweder nach Bereitstellung oder nach Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I). Die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) kann dabei – wie oben definiert – über eine direkte Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) oder über Zugabe einer bereits fertig synthetisierten oder aus Proben isolierten Nukleinsäure der Formel (I) durchgeführt werden. Eine Synthese der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) erfolgt dabei, bevorzugt analog zu dem zuvor Gesagten, nach im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Nukleinsäuresynthese, noch stärker bevorzugt nach dem Phosphoramiditverfahren (siehe z.B. 7).

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Lipid-Modifikation einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) am 5'-Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch besonders modifizierte Phosphoramidite im Anschluß an ein Phosphoramiditverfahren zur Synthese der Nukleinsäure. Solche relativ einfach synthetisch zugänglichen Amidite werden üblicherweise als letztes Monomer auf eine kommerziell erhältliche oder auf eine fertig synthetisierte Nukleinsäure aufgekuppelt. Diese Reaktionen zeichnen sich durch eine relativ schnelle Reaktionskinetik und sehr hohe Kupplungsausbeuten aus. Die Synthese der modifizierten Amidite erfolgt bevorzugt durch die Umsetzung eines Phosphoramidits, z.B. β-Cyanoethyl-monochlorophosphoramidit (Phosphorigsäure-mono-(2-cyanoethylester)-diisopropyl-amid-chlorid), mit einem in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. in absolutem Dichlormethan, gelösten Alkohol eines wie oben definierten Lipids, z.B. einem Lipidalkohol von Tocopherol, Cholesterol, Hexadecanol, DMT-PEG, etc.. Ebenfalls bevorzugt wird der Reaktionslösung als Säurefänger DIPEA zugesetzt.

Diese für die Synthese der erfindungsgemäßen 5'-Lipid-modifizierten Nukleinsäuren verwendeten Phosphoramidite sind gegenüber Hydrolyse relativ beständig und können (vor der Synthese) mit Kieselgel chromatographisch gereinigt werden. Dafür wird dem Eluenten typischerweise eine kleine Menge einer schwachen Base wie z.B. Triethylamin zugesetzt, um eine Zersetzung des Amidits zu vermeiden. Wichtig ist dabei, dass diese Base wieder vollständig aus dem Produkt entfernt wird, um schlechte Kupplungsausbeuten zu vermeiden. Die kann z.B. durch einfaches Trocknen im Vakuum erfolgen, bevorzugt jedoch durch Reinigung der Phosphoramidite durch ihre Fällung aus tert-Butylmetylether mit Pentan. Falls die verwendeten lipidmodifizierten Amidite eine sehr hohe Viskosität aufweisen, z.B. als zähes Öl vorliegen, kann auch eine (zügige) Säulenchromatographie erfolgen, welche es ermöglicht auf Triethylamin als Base zu verzichten. Eine solche Aufreinigung wird typischerweise jedoch nicht bei PEG-modifizierten Amiditen durchgeführt, da diese die säurelabile DMT-Schutzgruppe enthalten.

Für die Kupplungsreaktion der Lipid-modifizierten Phosphoramidite auf das 5'-Ende einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) werden bevorzugt solche Lösungsmittel eingesetzt, in denen die verwendeten Amidite in ausreichender Weise löslich sind. So kann z.B. bedingt durch die hohe Lipophilie der erfindungsgemäß verwendeten Amidite deren Löslichkeit in Acetonitril begrenzt sein. Neben Acetonitril als typischerweise verwendetem Lösungsmittel wird daher für die Kupplungsreaktionen bevorzugt eine Lösung von chlorierten Kohlenwasserstoffen eingesetzt, z.B. eine 0,1 M Lösung in (absolutem) Dichlormethan. Die Verwendung von Dichlormethan erfordert jedoch einige Änderungen im Standardprotokoll des Synthesezyklus. So werden z.B., um das Ausfallen des Amidits in den Leitungen des Syntheseautomaten und auf dem Trägermaterial zu vermeiden, alle Ventile und Leitungen, die mit dem Amidit in Kontakt geraten, vor und nach dem eigentlichem Kupplungsschritt mit (absolutem) Dichlormethan gespült und trockengeblasen.

Bei Verwendung von Lipid-modifizierten Amiditen ergeben sich typischerweise hohe Kupplungsausbeuten, die mit der Kupplungsausbeute von üblicherweise im Stand der Technik verwendeten Amiditen vergleichbar sind. Dabei verläuft die Kinetik der Reaktion von Lipid-modifizierten Amiditen allgemein langsamer. Aus diesem Grund werden gegenüber Standardprotokollen die Kupplungszeiten bei Verwendung von Lipid-modifizierten Amiditen bevorzugt (deutlich) verlängert. Solche Kupplungszeiten können durch einen Fachmann einfach bestimmt werden. Da auf einen Capping-Schritt nach der Kupplung verzichtet werden kann, ist es ebenfalls möglich, bei Bedarf einen weiteren Synthesezyklus mit demselben Lipid-modifizierten Amiditen durchzuführen, um die Gesamtausbeute der Reaktion zu erhöhen. In diesem Fall wird üblicherweise, z.B. bei DMT-modifizierten Lipiden wie DMT-PEG, der Detritylierungsschritt nicht ausgeführt.

Bei der Synthese von erfindungsgemäßen 5'-Lipid-modifizierten Nukleinsäuren kann der Phosphittriester, über den das Lipid an die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) gebunden wird, durch ein Sulfurierungsmittel oxidiert werden. Dazu wird bevorzugt ein solches Sulfurierungsmittel verwendet, das die Oxidation des Phosphotriesters möglichst vollständig erreicht. Andernfalls kann ggf. die Sulfurierungsreaktion, z.B. aus sterischen Gründen, so unvollständig ablaufen, dass nach der ammoniakalischen Abspaltung und Entschützung der MON nur wenig oder kein Produkt erhalten wird. Dieses Phänomen ist abhängig von der Art der Modifizierung, dem eingesetzten Sulfurierungsmittel und den Sulfurierungsbedingungen. Bevorzugt wird daher die Oxidation mit Iod durchgeführt. Hierdurch wird zwar eine Phosphodiesterbindung eingeführt, durch die Nachbarschaft des Lipidrestes ist jedoch nicht zu erwarten, dass diese Bindung als Substrat von Nukleasen erkannt wird.

Bei einer Lipid-Modifikation können in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) enthaltene Linker oder (bifunktionellen) Lipide oder, ggf., die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) selbst, wie zuvor beschrieben, direkt oder indirekt an ein Trägermaterial gekoppelt werden. Eine direkte Kopplung erfolgt dabei bevorzugt unmittelbar mit dem Trägermaterial, während eine indirekte Kopplung an das Trägermaterial typischerweise über ein weiteres (Kopplungs-)Molekül erfolgt. Die durch die Kopplung an ein Trägermaterial entstehende Bindung weist bevorzugt eine (spaltbare) kovalente Bindung mit dem Linker oder bifunktionellen Lipid und/oder eine (spaltbare) kovalente Bindung mit der Festphase auf. Ms (Kopplungs-)Molekül geeignete Verbindungen sind z.B. Dicarbonsäuren, bspw. Succinylreste (= Succinylanker), Oxalylreste (= Oxalylanker), etc.. Linker, (bifunktionelle) Lipide oder ggf. erfindungsgemäße Nukleinsäuren der Formel (I), die wie z.B. Aminoalkylreste (bspw. Aminopropyl- oder Aminohexanylreste) eine freie Aminofunktion tragen, können über einen Phtalimid-Linker an das Trägermaterial gebunden werden. Thiolhaltige Linker, (bifunktionelle) Lipide oder ggf. erfindungsgemäße Nukleinsäuren der Formel (I) können als Disulfid an das Trägermaterial gebunden werden. Als Trägermaterial sind im Zusammenhang mit dieser Erfindung insbesondere Festphasen wie CPG, Tentagel®, aminofunktionalisiertes PS-PEG (Tentagel® S NH2) etc., bevorzugt Tentagel® oder aminofunktionalisiertes PS-PEG (Tentagel® S NH2), geeignet. Gemäß einer besonderen Ausführungsform können zur Kopplung an ein Trägermaterial z.B. die Succinate der beschriebenen erfindungsgemäß verwendeten Linker oder bifunktionellen Lipide bevorzugt mit TBTU/NMM (1H-Benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-tetramethyluroni umtetrafluoroborat/N-Methylmorpholin) als Kupplungsreagenz auf aminofunktionalisiertem PS-PEG (Tentagel® S NH2) gekoppelt werden. Typischerweise werden bei PS-PEG Trägermaterialien im üblicherweise verwendeten 1 μmol-Maßstab die besten Resultate mit Beladungen zwischen 50 und 100 μmol/g erreicht (E. Bayer, K. Bleicher, M. Maier Z Naturforsch. 50b (1995) 1096). Sollen erfindungsgemäß jedoch Nukleotide im größeren Maßstab (large scale) synthetisiert werden, ist die Beladung der Trägermaterialien bevorzugt möglichst hoch (≥ 100 μmol). Erfindungsgemäß führt ein solches Verfahren ebenfalls zu guten Kupplungsausbeuten (M. Gerster, M. Maier, N. Clausen, J. Schewitz, E. Bayer Z Naturforsch. 52b (1997) 110). So können z.B. Trägermaterialien wie z.B. Harze mit bis zu 138 μmol/g Beladung oder ggf. mehr mit guten Syntheseausbeuten verwendet werden. Da die Kupplungsausbeuten mit den zuvor beschriebenen Linkern oder bifunktionellen Lipiden annähernd 100% betragen, kann über die Stöchiometrie dieser Verbindungen relativ genau die Beladung des Trägermaterials eingestellt werden. Die Kontrolle der Beladung erfolgt bevorzugt über die spektroskopische Quantifizierung der abgespaltenen DMT-Schutzgruppe (siehe experimenteller Teil). Die auf dem Trägermaterial noch vorhandenen restlichen Aminofunktionen können mit Acetanhydrid gecappt werden. Dieses Capping wird normalerweise im Anschluss an die Belegung des Trägermaterials durchgeführt, kann aber auch direkt bei der Nukleinsäure-Synthese, z.B. am DNA-Synthesizer, ausgeführt werden. Für die Synthese von Lipid-modifizierten Nukleinsäuren auf den derivatisierten PS-PEG-Trägermaterialien werden bevorzugt speziell für Tentagel® entwickelte Synthesezyklen verwendet, die die charakteristischen Eigenschaften des Materials berücksichtigen (E. Bayer, M. Maier, K. Bleicher, H.-J. Gaus Z. Naturforsch. 50b (1995) 671, E. Bayer, K. Bleicher, M. Maier Z. Naturforsch. 50b (1995) 1096.). Bevorzugte Änderungen im Vergleich zum Standardprotokoll umfassen.

  • • Verlängerte Reaktionszeiten bei den Kupplungs-, Capping- und Oxidationsschritten;
  • • Erhöhung der Zahl der Detritylierungsschritte;
  • • Verlängerte Waschschritte nach jedem Schritt;
  • • Verwendung einer ascorbinsäurehaltigen Waschlösung (0,1 M in Dioxan/Wasser = 9:1) nach dem üblicherweise notwendigen Oxidationsschritt (zur Oxidation des Phosphittriesters) während des Amiditverfahrens, um Spuren von Iod zu entfernen.

Dabei ist zu beachten, dass die Art der Modifizierung einen Einfluss auf die einzelnen Schritte des Synthesezyklus haben kann. Z.B. wird bei PEG1500-derivatisierten Trägermaterialien eine stark verlangsamte Reaktionskinetik beobachtet, was eine nochmalige Erweiterung der Detritylierungsschritte und eine zusätzliche Verlängerung der Kupplungsdauer notwendig macht. Solche Änderungen und Anpassungen liegen im Bereich des normalen Könnens eines Fachmanns und können im Rahmen der vorliegenden Offenbarung jederzeit vorgenommen werden. Mit diesen derart veränderten Reaktionszyklen können sowohl Lipid-modifizierte Phosphordiester als auch Phosphorothioate synthetisiert werden. Die Kupplungsausbeuten von Amicliten auf erfindungsgemäß verwendeten Linkern oder bifunktionellen Lipiden werden nicht durch die Lipidreste beeinträchtigt, sondern entsprechen üblichen Werten (97–99%). Die Möglichkeit der 5'-Derivatisierung sowie die Einführung weiterer Modifizierungen z.B. an Base, Zucker oder Phosphatrückgrat bleibt bei Verwendung solcher 3'-Modifizierungen bestehen.

Gemäß einer Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) als immunstimulierendes Adjuvanz vorliegen.

Eine als „immunstimulierendes Adjuvanz" vorliegende erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) ist bevorzugt in der Lage eine adjuvante, also nicht Antigen-spezifische Immunreaktion auszulösen, bevorzugt immunstimulierend. Eine Immunreaktion kann allgemein auf verschiedene Art und Weise hervorgerufen werden. Ein wesentlicher Faktor für eine passende Immunantwort ist dabei die Stimulation unterschiedlicher T-Zell-Subpopulationen. T-Lymphozyten differenzieren typischerweise in zwei Subpopulationen, die T-Helfer 1 (Th1)- und T-Helfer 2 (Th2)-Zellen, mit denen das Immunsystem in der Lage ist, intrazelluläre (Th1) und extrazelluläre (Th2) Pathogene (z.B. Antigene) zu vernichten. Die beiden Th-Zellpopulationen unterscheiden sich im Muster der von ihnen produzierten Effektorproteine (Zytokine). So unterstützen Th1-Zellen die zelluläre Immunantwort durch Aktivierung von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen. Th2-Zellen fördern dagegen die humorale Immunantwort durch Stimulierung der B-Zellen zur Verwandlung in Plasmazellen und durch Bildung von Antikörpern (z.B. gegen Antigene). Von hoher Wichtigkeit ist bei der Immunantwort daher das Th1/Th2-Verhältnis. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird durch das immunstimulierende Adjuvanz in Form der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) das Th1/Th2-Verhältnis der Immunantwort bevorzugt in Richtung der zellulären Antwort, d.h. der Th1-Antwort, verschoben und damit eine überwiegend zelluläre Immunantwort induziert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das immunstimulierende Adjuvanz in Form der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) bzw die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) als Adjuvanz, mit weiteren, im Stand der Technik bekannten Adjuvanzien kombiniert werden. Für diese Zwecke geeignete Adjuvantien im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere solche Verbindungen, die die biologische(n) Eigenschaft(en) der (modifizierten oder nicht-modifizierten) erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) (durch einen odere mehrere Mechanismen) verstärken, d.h. insbesondere die immunstimulierende Wirkung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) potenzieren. Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Adjuvanzien schießen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, wie zuvor beschriebene stabilisierende kationische Peptide bzw. Polypeptide, wie Protamin, Nukleolin, Spermin oder Spermidin und kationische Polysaccharide, insbesondere Chitosan, TDM, MDP, Muramyldipeptid, Pluronics, Alaun-Lösung, Aluminiumhydroxid, ADJUMERTM (Polyphosphazen); Aluminumphosphat-Gel; Glucane aus Algen; Algammulin; Aluminumhydroxid-Gel (Alaun); stark Protein-adsorbierendes Aluminumhydroxid-Gel; niedrig-viskoses Aluminumhydroxid-Gel; AF oder SPT (Emulsion von Squalane (5%), Tween 80 (0.2%), Pluronic L121 (1.25%), Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7.4); AVRIDINETM (Propandiamin); BAY R1005TM ((N-(2-Deoxy-2-L-leucylamino-b-D-glucopyranosyl)-N-octadecyldodecanoyl-amidhydroacetat); CALCITRIOLTM (1,25-Dihydroxyvitamin D3); Calciumphosphat-Gel; CAPTM (Calciumphosphat-Nanopartikel); Cholera-Holotoxin, Cholera-Toxin-A1-Protein-A-D-Fragment-Fusionsprotein, die Untereinheit B des Choleratoxins; CRL 1005 (Block Copolymer P1205); Cytokin-enthaltende Liposome; DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid); DHEA (Dehydroepiandrosteron); DMPC (Dimyristoylphosphatidylcholin); DMPG (Dimyristoylphosphatidylglycerin); DOC/Alaun-Komplex (Deoxycholinsäurenatriumsalz); Freund'sches vollständiges Adjuvanz; Freund'sches unvollständiges Adjuvanz; Gamma Inulin; Gerbu Adjuvanz (Mischung aus: i) N-Acetylglucosaminyi-(P1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin (GMDP), ii) Dimethyldioctadecylammoniumchlorid (DDA), iii) Zink-L-Prolin-Salz-Komplex (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-acetylglucosaminyl-(b1-4)-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin); Imiquimod (1-(2-Methypropyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin); ImmTherTM (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-glycerindipalmitat); DRVs (Immunoliposome hergestellt aus Dehydrations-Rehyrdrations-Vesikeln); Interferon-γ; Interleukin-1β; Interleukin-2; Interleukin-7; Interleukin-12; ISCOMSTM („Immune Stimulating Complexes"); ISCOPREP 7.0.3.TM; Liposome; LOXORIBINETM (7-Allyl-8-oxoguanosin); LT Orales Adjuvanz (E. coli labiles Enterotoxin-Protoxin); Microspheren and Micropartikel jeder Zusammensetzung; MT59TM; (Squalene-Wasser-Emulsion); MONTANIDE ISA 51TM (aufgereinigtes unvollständiges Freund'sches Adjuvanz); MONTANIDE ISA 720TM (metabolisierbares Öl-Adjuvanz); MPLTM (3-Q-Desacyl-4'-monophosphoryl-lipid A); MTP-PE- und MTP-PE-Liposome ((N-Acetyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoylsn-glycero-3-(hydroxyphosphoryloxy))ethylamid, Mononatriumsalz); MURAMETIDETM (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINETM und D-MURAPALMITINETM (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-Glycerindipalmitoyl); NAGO (Neuraminidase-galactoseoxidase); Nanospheren oder Nanopartikel jeder Zusammensetzung; NISVs (Nicht-ionische Tensid-Vehikel, „Nonlonic Surfactant Vesicles"); PLEURANTM (β-Glucan); PLGA, PGA and PLA (Homo- und Co-Polymere von Milchsäure und Glykolsäure; Micro-/Nanospheren); PLURONIC L121TM; PMMA (Polymethylmethacrylat); PODDSTM (Oroteinoid-Microspheren); Polyethylen-Carbamat-Derivate; Poly-rA: Poly-rU (Polyadenylsäure-Polyuridyisäure-Komplex); Polysorbate 80 (Tween 80); Protein-Cochleate (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STIMULONTM (QS-21); Quil-A (Quil-A-Saponin); S-28463 (4-Amino-otec-dimethyl-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-cichinolin-1-ethanol); SAF-1TM („Syntex Adjuvant Formulation"); Sendai Proteoliposome und Sendai-enthaltende Lipid-Matrices; Span-85 (Sorbitantrioleat); Specol (Emulstion von Marcol 52, Span 85 und Tween 85); Squalen oder Robane® (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan und 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-Tetracosahexan); Stearyltyrosin (Octadecyltyrosinhydrochlorid); Theramid® (N-Acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-dipalmitoxypropylamid); Theronyl-MDP (TermurtideTM oder [thr1]-MDP; N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin); Ty-Partikel (Ty-VLPs oder Virus-artige Partikel); Walter-Reed-Liposome (Liposome enthaltend an Aluminiumhydroxid adsorbiertes Lipid A), und ähnliches, etc.. Des weiteren sind Lipopeptide, wie Pam3Cys, ebenfalls besonders geeignet, um mit der als immunstimulierendem Adjuvanz vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) kombiniert zu werden (vgl. Deres et al, Nature 1989, 342: 561–564).

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I), mindestens einen Wirkstoff und optional einen pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder weitere Hilfs- und Zusatzstoffe und/oder Adjuvanzien.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine sichere und effektive Menge einer wie oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I). Wie hier verwendet bedeutet "sichere und effektive Menge" eine solche Menge der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I), die ausreichend ist, um signifikant eine positive Modifikation eines zu behandelnden Zustands zu induzieren, z.B. einer Tumor- oder Infektionserkrankung. Gleichzeiztig ist eine "sichere und effektive Menge” jedoch gering genug, um schwerwiegende Nebeneffekte zu vermeiden, also ein vernünftiges Verhältnis von Vorteil und Risiko zu ermöglichen. Die Festlegung dieser Grenzen liegt typischerweise innerhalb des Bereichs vernünftiger medizinischer Urteilskraft. In Bezug auf die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) bedeutet der Begriff „sichere und effektive Menge" bevorzugt eine solche Menge, die geeignet ist, das Immunsystem in einer solchen Weise zu stimulieren, dass keine überschießenden bzw. schädlichen Immunreaktionen erzielt werden, jedoch bevorzugt auch keine solchen Immunreaktionen unterhalb eines messbaren Niveaus. Eine „sichere und effektive Menge" des der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) wird im Zusammenhang mit dem besonderen zu behandelnden Zustand variieren, sowie dem Alter und dem physischen Zustand des zu behandelnden Patienten, der Schwere des Zustandes, der Dauer der Behandlung, der Natur der begleitenden Therapie, des verwendeten besonderen pharmazeutisch geeigneten Trägers und ähnlichen Faktoren innerhalb des Wissens und der Erfahrung des begleitenden Arztes. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können erfindungsgemäß für humane und wie auch für veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt werden.

Zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) enthält die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bevorzugt mindestens einen Wirkstoff. Ein Wirkstoff ist in diesem Zusammenhang eine Verbindung, die einen therapeutischen Effekt gegen eine bestimmte Indikation aufweist, bevorzugt Krebserkrankungen oder Infektionserkrankungen. Solche Verbindungen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, (therapeutisch wirksame) niedermolekulare organische oder anorganische Verbindungen (Molekulargewicht kleiner als 5.000, bevorzugt kleiner als 1.000), Zucker, Antigene, oder Antikörper, bereits im Stand der Technik bekannte Therapeutika, etc.. Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die zuvor beschriebene erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) selbst ein Wirkstoff sein. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn im Falle einer Lipidmodifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) das Lipid ein therapeutisch aktives Molekül darstellt, wie z.B. ein wie oben beschriebenes Vitamin, oder Steroid, bspw. α-Tocopherol (Vitamin E), D-α-Tocopherol, L-α-Tocopherol, D,L-α-Tocopherol, Vitamin E-Succinat (VES), Vitamin A und dessen Derivate, Vitamin D und dessen Derivate, Vitamin K und dessen Derivate, etc..

Gemäß einer ersten Ausführungsform liegt der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Wirkstoff als Antigen bzw. als Immunogen vor. Unter einem „Antigen” wie auch einem „Immunogen" ist dabei jede Struktur zu verstehen, welche die Bildung von Antikörpern und/oder die Aktivierung einer zellulären Immunantwort hervorrufen kann, also eine spezifische (und keine adjuvante) Immunantwort auslöst. Erfindungsgemäß werden daher die Begriffe „Antigen" und „Immunogen" synonym verwendet. Beispiele von Antigenen sind Peptide, Polypeptide, also auch Proteine, Zellen, Zellextrakte, Polysaccharide, Polysaccharidkonjugate, Lipide, Glykolipide und Kohlenhydrate. Als Antigene kommen bspw. Tumorantigene, virale, bakterielle, Pilz- und protozoologische Antigene in Betracht. Bevorzugt sind dabei Oberflächenantigene von Tumorzellen und Oberflächenantigene, insbesondere sekretierte Formen, viraler, bakterieller, Pilz- oder protozoologischer Pathogene. Selbstverständlich kann das Antigen z.B. in einer erfindungsgemäßen Vakzine, auch in Form eines an einen geeigneten Träger gekoppelten Haptens vorliegen.

Der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Wirkstoff kann gemäß einer zweiten Ausführungsform als Antikörper vorliegen. In diesem Zusammenhang kann jeder therapeutisch geeignete Antikörper eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist erfindungsgemäß ein Antikörper, der gegen Antigene, Proteine oder Nukleinsäuren gerichtet ist, die eine wesentliche Rolle bei Krebserkrankungen oder Infektionserkrankungen aufweisen, z.B. Zelloberflächenproteine, Tumorsupressorgene oder deren Inhibitoren, Wachstums- und Elongationsfaktoren, Apoptoserelevante Proteine, Tumorantigene, oder Antigene, wie zuvor beschrieben, etc..

Gemäß einer dritten Ausführungsform liegt der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Wirkstoff als Nukleinsäure vor. Eine solche Nukleinsäure kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, und als Homo- oder -Heteroduplex sowie linear oder zirkulär vorliegen. Eine als Wirkstoff in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Nukleinsäure ist dabei in ihrer Länge nicht beschränkt und kann jede natürlich vorkommende Nukleinsäuresequenz oder deren Komplement oder ein Fragment davon umfassen. Ebenfalls kann die in diesem Zusammenhang eingesetzte Nukleinsäure teilweise oder vollständig synthetischer Natur sein. Beispielsweise kann die Nukleinsäure eine solche Nukleinsäure umfassen, die ein (therapeutisch relevantes) Protein kodiert, und/oder die in der Lage ist, eine Immunreaktion hervorzurufen, z.B. ein Antigen oder eine ein Antigen kodierende Nukleinsäure. Ein Antigen ist dabei bevorzugt ein Antigen wie zuvor beschrieben.

Gemäß einer ersten bevorzugten Alternative der vorgenannten Ausführungsform liegt die als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene Nukleinsäure als mRNA vor. Eine solche mRNA kann zur erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in ihrer nackten Form zugegeben werden oder in einer stabilisierten Form, die den Abbau der Nukleinsäure in vivo, z.B. durch Exo- und/oder Endonukleasen verringert oder gar verhindert.

Beispielsweise kann die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung als Wirkstoff enthaltene mRNA mit einem wie oben definierten 5'-Cap und/oder einem Poly-A-Schwanz am 3'-Ende von mindestens 50 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 70 Nukleotiden, mehr bevorzugt mindestens 100 Nukleotiden, besonders bevorzugt mindestens 200 Nukleotiden stabilisiert werden. Wie bereits erwähnt, ist die endständige Struktur ist dabei in vivo von entscheidender Bedeutung. Über diese Strukturen wird die RNA als mRNA erkannt und der Abbau reguliert. Darüber hinaus gibt es jedoch weitere Prozesse, die RNA stabilisieren bzw. destabilisieren. Viele diese Prozesse sind noch unbekannt, oftmals scheint jedoch eine Wechselwirkung zwischen der RNA und Proteinen dafür maßgeblich zu sein. Bspw. wurde kürzlich ein „mRNA-Surveillance-System" beschrieben (Heilerin und Parker, Ann. Rev. Genet. 1999, 33: 229 bis 260), bei dem durch bestimmte Feedback-Protein-Wechselwirkungen im Cytosol unvollständige oder Nonsense-mRNA erkannt und dem Abbau zugänglich gemacht wird, wobei ein Hauptteil dieser Prozesse durch Exonucleasen vollzogen wird.

Ebenso kann die Stabilisierung der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung als Wirkstoff enthaltenen mRNA dadurch erfolgen, dass die mRNA mit einer kationischen Verbindung, insbesondere einer polykationischen Verbindung, bspw. einem (poly)kationischen Peptid oder Protein, assoziiert bzw. komplexiert oder daran gebunden ist. Insbesondere ist dabei die Verwendung von Protamin, Nukleolin, Spermin oder Spermidin als polykationischem, Nukleinsäure-bindenden Protein besonders wirksam. Des weiteren ist die Verwendung anderer kationischer Peptide oder Proteine, wie Poly-L-Lysin oder Histonen, ebenfalls möglich. Diese Vorgehensweise zur Stabilisierung von mRNA ist in EP-A-1083232 beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt in die vorliegende Erfindung vollumfänglich eingeschlossen ist. Weitere bevorzugte kationische Substanzen, die zur Stabilisierung der als Wirkstoff enthaltnen mRNA verwendet werden können, schließen kationische Polysaccharide, bspw. Chitosan, Polybren, Polyethylenimin (PEI) oder Poly-L-Lysin (PLL), etc., ein. Die Assoziierung oder Komplexierung der mRNA mit kationischen Verbindungen erhöht bevorzugt neben der bereits vorteilhaften Wirkung der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure als Adjuvanz bei der Verbesserung der Zellpermeabilität den Transfer der als Wirkstoff enthaltenen mRNA in die zu behandelnden Zellen bzw. den zu behandelnden Organismus.

Eine weitere Möglichkeit zur Stablisierung von mRNA, die als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen kann, ist die gezielte Veränderung der Sequenz der mRNA durch Entfernen oder Veränderung sogenannter destabilisierender Sequenzelemente (DSE). An diese destabilisierende Sequenzelemente (DSE), die insbesondere bei eukaryotischer mRNA auftreten, können Signalproteine binden und den enzymatischen Abbau der mRNA in vivo regulieren. Daher werden zur weiteren Stabilisierung der als Wirkstoff enthaltenen mRNA bevorzugt ein oder mehrere Veränderungen gegenüber dem entsprechenden Bereich der Wildtyp-mRNA vorgenommen, so dass keine destabilisierenden Sequenzelemente enthalten sind. Selbstverständlich ist es erfindungsgemäß ebenfalls bevorzugt, gegebenenfalls in den nicht-translatierten Bereichen (3'- und/oder 5'-UTR) vorhandene DSE aus der mRNA zu eliminieren. Beispiele der vorstehenden DSE sind AU-reiche Sequenzen ("AURES"), die in 3'-UTR-Abschnitten zahlreicher instabiler mRNA vorkommen (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 bis 1674). Die als Wirkstoff eingesetzte mRNA ist daher vorzugsweise derart gegenüber der Wildtyp-mRNA verändert, dass sie keine derartigen destabilisierenden Sequenzen aufweist. Dies gilt auch für solche Sequenzmotive, die von möglichen Endonukleasen erkannt werden, bspw. die Sequenz GAACAAG, die im 3' UTR-Segment des für den Transferin-Rezeptor kodierenden Gens enthalten ist (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 bis 1980). Vorzugsweise werden auch diese Sequenzmotive aus der erfindungsgemäßen Lipid-modifizierten Nukleinsäure eliminiert.

Die als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gegebenenfalls vorliegende mRNA kann weiterhin z.B. für eine gegebenenfalls gewünschte effiziente Translation, so verändert werden, dass eine wirksame Bindung der Ribosomen an die Ribosomen-Bindungsstelle (Kozak-Sequenz: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID NO: 78), das AUG bildet das Startcodon) erfolgt. Diesbezüglich ist festgestellt worden, dass ein erhöhter A/U-Gehalt um diese Stelle herum eine effizientere Ribosomen-Bindung an die mRNA ermöglicht.

Des weiteren ist es möglich, in die als Wirkstoff verwendete mRNA eine oder mehrere sog. IRES (engl. "internal ribosomal entry side") einzufügen. Eine IRES kann so als alleinige Ribosomen-Bindungsstelle fungieren, sie kann jedoch auch zur Bereitstellung einer mRNA dienen, die mehrere Peptide bzw. Polypeptide kodiert, die unabhängig voneinander durch die Ribosomen translatiert werden sollen ("multicistronische mRNA"). Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer IRES-Sequenzen sind diejenigen aus Picornaviren (z.B. FMDV), Pestviren (CFFV), Polioviren (PV), Enzephalo-Myocarditis-Viren (ECMV), Maul-und-Klauenseuche-Viren (FMDV), Hepatitis-C-Viren (HCV), Viren des klassischen Schweinefiebers (CSFV), Murines-Leukoma-Virus (MLV), Simean-Immundefizienz-Viren (SIV) oder Cricket-Paralysis-Viren (CrPV).

Die als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung gegebenenfalls verwendete mRNA kann ebenfalls in ihren 5'- und/oder 3'-nicht translatierten Bereichen Stabilisierungssequenzen aufweisen, die befähigt sind, die Halbwertszeit der mRNA im Cytosol zu erhöhen. Diese Stabilisierungssequenzen können eine 100%ige Sequenzhomologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen aufweisen, die in Viren, Bakterien und Eukaryoten auftreten, sie können aber auch teilweise oder vollständig synthetischer Natur sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können die nicht-translatierten Sequenzen (UTR) des [3-Globingens, bspw. von Homo sapiens oder Xenopus laevis, genannt werden. Ein anderes Beispiel einer Stabilisierungssequenz weist die allgemeine Formel (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SEQ ID NO: 79) auf, die im 3'UTR der sehr stabilen mRNA enthalten ist, die für α-Globin, α-(I)-Collagen, 15-Lipoxygenase oder für Tyrosin-Hydroxylase kodiert (vgl. Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 bis 2414). Selbstverständlich können derartige Stabilisierungssequenzen einzeln oder in Kombination miteinander als auch in Kombination mit anderen, einem Fachmann bekannten, Stabilisierungssequenzen verwendet werden.

Zur weiteren Erhöhung einer gegebenenfalls gewünschten Translation kann die als Wirkstoff verwendete mRNA gegenüber einer entsprechenden Wildtyp-mRNA folgende Modifikationen aufweisen, die entweder alternativ oder in Kombination vorliegen können. Zum einen kann der G/C-Gehalt des für ein Peptid oder Polypeptid kodierenden Bereichs der modifizierten mRNA größer sein als der G/C-Gehalt des kodierenden Bereichs der für das Peptid oder Polypeptid kodierenden Wildtyp-mRNA, wobei die kodierte Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp unverändert ist. Diese Modifikation beruht auf der Tatsache, dass für eine effiziente Translation einer mRNA die Sequenzabfolge des zu translatierenden Bereichs der mRNA wesentlich ist. Dabei spielt die Zusammensetzung und die Abfolge der verschiedenen Nukleotide eine große Rolle. Insbesondere sind Sequenzen mit erhöhtem G(Guanosin)/C(Cytosin)-Gehalt stabiler als Sequenzen mit einem erhöhten A(Adenosin)/U(Uracil)-Gehalt. Daher werden erfindungsgemäß unter Beibehaltung der translatierten Aminosäureabfolge die Codons gegenüber der Wildtyp-mRNA derart variiert, dass sie vermehrt G/C-Nukleotide beinhalten. Da mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure kodieren (Degeneration des genetischen Codes), können die für die Stabilität günstigsten Codons ermittelt werden (alternative Codonverwendung, engl. "codon usage"). In Abhängigkeit von der durch die mRNA zu kodierenden Aminosäure sind unterschiedliche Möglichkeiten zur Modifikation der mRNA-Sequenz gegenüber der Wildtyp-Sequenz möglich. Im Fall von Aminosäuren, die durch Codons kodiert werden, die ausschließlich G- oder C-Nukleotide enthalten, ist keine Modifikation des Codons erforderlich. So erfordern die Codons für Pro (CCC oder CCG), Arg (CGC oder CGG), Ala (GCC oder GCG) und Gly (GGC oder GGG) keine Veränderung, da kein A oder U vorhanden ist. In folgenden Fällen werden die Codons, welche A- und/oder U-Nukleotide enthalten, durch Substituieren anderer Codons, welche die gleichen Aminosäuren kodieren, jedoch kein A und/oder U enthalten, verändert. Beispiele sind: Die Codons für Pro können von CCU oder CCA zu CCC oder CCG verändert werden; die Codons für Arg können von CGU oder CGA oder AGA oder AGG zu CGC oder CGG verändert werden; die Codons für Ala können von GCU oder GCA zu GCC oder GCG verändert werden; die Codons für Gly können von GGU oder GGA zu GGC oder GGG verändert werden. In anderen Fällen können A bzw. U-Nukleotide zwar nicht aus den Codons eliminiert werden, es ist jedoch möglich, den A- und U-Gehalt durch Verwendung von Codons zu vermindern, die weniger A- und/oder U-Nukleotide enthalten. Zum Beispiel: Die Codons für Phe können von UUU zu UUC verändert werden; die Codons für Leu können von UUA, CUU oder CUA zu CUC oder CUG verändert werden; die Codons für Ser können von UCU oder UCA oder AGU zu UCC, UCG oder AGC verändert werden; das Codon für Tyr kann von UAU zu UAC verändert werden; das Stop-Codon UAA kann zu UAG oder UGA verändert werden; das Codon für Cys kann von UGU zu UGC verändert werden; das Codon His kann von CAU zu CAC verändert werden; das Codon für Gin kann von CAA zu CAG verändert werden; die Codons für Ile können von AUU oder AUA zu AUC verändert werden; die Codons für Thr können von ACU oder ACA zu ACC oder ACG verändert werden; das Codon für Asn kann von AAU zu AAC verändert werden; das Codon für Lys kann von AAA zu AAG verändert werden; die Codons für Val können von GUU oder GUA zu GUC oder GUG verändert werden; das Codon für Asp kann von GAU zu GAC verändert werden; das Codon für Glu kann von GAA zu GAG verändert werden. Im Falle der Codons für Met (AUG) und Trp (UGG) besteht hingegen keine Möglichkeit der Sequenzmodifikation. Die vorstehend aufgeführten Substitutionen können selbstverständlich einzeln aber auch in allen möglichen Kombinationen zur Erhöhung des G/C-Gehalts der modifizierten mRNA gegenüber der ursprünglichen Sequenz verwendet werden. So können beispielsweise alle in der ursprünglichen (Wildtyp-)Sequenz auftretenden Codons für Thr zu ACC (oder ACG) verändert werden. Vorzugsweise werden jedoch Kombinationen der vorstehenden Substitutionsmöglichkeiten genutzt, z.B.: Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Thr kodierenden Codons zu ACC (oder ACG) und Substitution aller ursprünglich für Ser kodierenden Codons zu UCC (oder UCG oder AGC); Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Ile kodierenden Codons zu AUC und Substitution aller ursprünglich für Lys kodierenden Codons zu AAG und Substitution aller ursprünglich für Tyr kodierenden Codons zu UAC; Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Arg kodierenden Codons zu CGC (oder CGG); Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu kodierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala kodierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Gly kodierenden Codons zu GGC (oder GGG) und Substitution aller ursprünglich für Asn kodierenden Codons zu AAC; Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val kodierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller usprünglich für Phe kodierenden Codons zu UUC und Substitution aller ursprünglich für Cys kodierenden Codons zu UGC und Substitution aller ursprünglich für Leu kodierenden Codons zu CUG (oder CUC) und Substitution aller ursprünglich für Gin kodierenden Codons zu CAG und Substitution aller ursprünglich für Pro kodierenden Codons zu CCC (oder CCC); usw.. Vorzugsweise wird der G/C-Gehalt des für das Peptid bzw. Polypeptid kodierenden Bereichs (bzw. jedes anderen gegebenenfalls vorhandenen weiteren Abschnitts) der mRNA um mindestens 7%-Punkte, mehr bevorzugt um mindestens 15%-Punkte, besonders bevorzugt um mindestens 20%-Punkte gegenüber dem G/C-Gehalt des kodierten Bereichs der für das entsprechende Peptid bzw. Polypeptid kodierenden Wildtyp-mRNA erhöht und liegt bevorzugt bei mindestens 50%, stärker bevorzugt bei mindestens 70% und am stärksten bevorzugt bei mindestens 90%. Besonders bevorzugt ist es in diesem Zusammenhang, den G/C-Gehalt der derart modifizierten mRNA im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz maximal zu erhöhen.

Eine weitere bevorzugte Modifikation einer als Wirkstoff in der pharmazeutishen Zusammensetzung ggf. verwendeten mRNA beruht auf der Erkenntnis, dass die Translationseffizienz auch durch eine unterschiedliche Häufigkeit im Vorkommen von tRNAs in Zellen bestimmt wird. Sind daher in einer RNA-Sequenz vermehrt sogenannte "seltene" Codons vorhanden, so wird die entsprechende mRNA deutlich schlechter translatiert als in dem Fall, wenn für relativ "häufige" tRNAs kodierende Codons vorhanden sind. Somit wird erfindungsgemäß in der als Wirkstoff verwendeten mRNA, der kodierende Bereich gegenüber dem entsprechenden Bereich der Wildtyp-mRNA derart verändert, dass mindestens ein Codon der Wildtyp-Sequenz, das für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodiert, gegen ein Codon ausgetauscht wird, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA. Durch diese Modifikation werden die RNA-Sequenzen derart modifiziert, dass Codons eingefügt werden, für die häufig vorkommende tRNAs zur Verfügung stehen. Welche tRNAs relativ häufig in der Zelle vorkommen und welche demgegenüber relativ selten sind, ist einem Fachmann bekannt; vgl. bspw. Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11 (6): 660–666. Durch diese Modifikation können erfindungsgemäß alle Codons der Wildtyp-Sequenz, die für eine in der Zelle relativ seltene tRNA kodieren, jeweils gegen ein Codon ausgetauscht werden, das für eine in der Zelle relativ häufige tRNA kodiert, welche jeweils die gleiche Aminosäure trägt wie die relativ seltene tRNA. Besonders bevorzugt ist es, den in der wie vorstehend beschriebenen mRNA erhöhten, insbesondere maximalen, sequenziellen G/C-Anteil mit den "häufigen" Codons zu verknüpfen, ohne die Aminosäuresequenz eines durch den kodierenden Bereich des mRNA-kodierten antigenen Peptids bzw. Polypeptids (ein oder mehrere) zu verändern. Antigene Peptide umfassen in diesem Zusammenhang alle bekannten antigenen Peptide, z.B. Tumorantigene, etc.. Spezifische Beispiele von Tumorantigenen sind u.a. 707-AP, AFP, ART-4, BAGE, β-Catenin/m, Bcr-abl, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (oder hTRT), iCE, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO-1, p190 minor bcr-abl, Pml/RAR, PRAME, PSA, PSM, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2 und WT1.

Gemäß einer zweiten bevorzugten Alternative der letztgenannten Ausführungsform liegt die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ggf. als Wirkstoff enthaltene Nukleinsäure als dsRNA, bevorzugt als siRNA, vor. Eine dsRNA, v.a. eine siRNA, ist insbesondere im Zusammenhang mit dem Phänomen der RNA-Interferenz von Interesse. Auf das Phänomen der RNA-Interferenz wurde man im Zuge der immunologischen Forschung aufmerksam. In den letzten Jahren wurde ein RNA-basierter Abwehrmechanismus entdeckt, der sowohl im Reich der Pilze, als auch im Pflanzen- und Tierreich vorkommt und wie ein „Immunsystem des Genoms" wirkt. Das System wurde ursprünglich unabhängig voneinander in verschiedenen Spezies, zuerst in C. elegans, beschrieben, ehe man die zugrundeliegenden Mechanismen der Vorgänge als identisch identifizieren konnte: RNA-vermittelte Virus-Resistenz in Pflanzen, PTGS („posttranscriptional gene silencing") bei Pflanzen, und RNA-Interferenz bei Eukaryoten basieren demnach auf einer gemeinsamen Funktionsweise. Die in vitro Technik der RNA-Interferenz (RNAi) beruht auf doppelsträngigen RNA-Molekülen (dsRNA), welche die sequenzspezifische Suppression der Genexpression auslösen (Zamore (2001) Nat. Struct. Biol. 9: 746–750; Sharp (2001) Genes Dev. 5: 485–490: Hannon (2002) Nature 41: 244–251). Die Aktivierung von Proteinkinase R und RNaseL bewirkt bei der Transfektion von Säugerzellen mit langer dsRNA unspezifische Effekte, wie z.B. eine Interferon-Antwort (Stark et al. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227–264; He und Katze (2002) Viral Ommunol. 15: 95–119). Diese unspezifischen Effekte werden bei Verwendung von kürzerer, bspw. 21- bis 23-merer, sog. siRNA (engl. „small interfering RNA") umgangen, da unspezifische Effekte durch siRNA, die kürzer als 30 bp ist, nicht ausgelöst werden (Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494–498). Kürzlich wurden dsRNA-Moleküle auch in vivo zur Anwendung gebracht (McCaffrey et al. (2002), Nature 418: 38–39; Xia et al. (2002), Nature Biotech. 20: 1006–1010; Brummeikamp etal. (2002), Cancer Cell 2: 243–247).

Die zusätzlich in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ggf. als Wirkstoff verwendete doppelsträngige RNA (dsRNA) enthält daher bevorzugt eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5'-(N17-29)-3', wobei N irgendeine Base ist und für Nukleotide steht. Die allgemeine Struktur setzt sich aus einer doppelsträngigen RNA mit einem aus Ribonukleotiden aufgebauten Makromolekül zusammen, wobei das Ribonukleotid aus einer Pentose (Ribose), einer organischen Base und einem Phosphat besteht. Hierbei bestehen die organischen Basen in der RNA aus den Purinbasen Adenosin (A) und Guanosin (G) sowie den Pyrimidinbasen Cytosin (C) und Uracil (U). Die zusätzlich in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ggf. als Wirkstoff verwendete dsRNA enthält derartige Nukleotide oder Nukleotidanaloga mit einer gerichteten Struktur. Vorzugsweise weisen erfindungsgemäß als Wirkstoff verwendete dsRNAs die allgemeine Struktur 5'-(N19-25)-3', stärker bevorzugt 5'-(N19-24)-3', noch stärker bevorzugt 5'-(N21-23)-3' auf, wobei N irgendeine Base ist. Hierbei werden bevorzugt zumindest 90%, vorzugsweise 95% und insbesondere 100% der Nukleotide einer als Wirkstoff verwendeten dsRNA komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA-Sequenz eines zuvor (als Wirkstoff) beschriebenen (therapeutisch relevanten) Proteins oder Antigens sein. 90% komplementär bedeutet hierbei, dass bei einer Länge einer erfindungsgemäß verwendeten dsRNA von bspw. 20 Nukleotiden diese höchstens 2 Nukleotide ohne entsprechende Komplementarität mit dem entsprechenden Abschnitt auf der (m)RNA aufweist. Die Sequenz der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ggf. verwendeten doppelsträngigen RNA ist mit ihrer allgemeinen Struktur vorzugsweise aber vollständig komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA eines zuvor als Wirkstoff beschriebenen Proteins oder Antigens.

Grundsätzlich können alle im kodierenden Bereich der (m)RNA auftretenden 17 bis 29, vorzugsweise 19 bis 25 Basenpaare langen Abschnitte als Zielsequenz für eine erfindungsgemäß zusätzlich in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ggf. als Wirkstoff verwendete dsRNA dienen. Gleichwohl können als Wirkstoff verwendete dsRNAs auch gegen Nukleotidsequenzen eines zuvor (als Wirkstoff) beschriebenen (therapeutisch relevanten) Proteins oder Antigens, die nicht im kodierenden Bereich liegen, gerichtet sein, insbesondere im nicht-kodierenden 5'-Bereich der (m)RNA, bspw. also gegen nicht-kodierende Bereiche der (m)RNA mit Regulationsfunktion. Die Zielsequenz der als Wirkstoff eingesetzten dsRNA eines zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens kann also im translatierten und nicht-translatierten Bereich der (m)RNA und/oder im Bereich der Steuerungselemente liegen. Auch kann die Zielsequenz einer als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ggf. verwendeten dsRNA im Überlappungsbereich von nicht-translatierter und translatierter Sequenz liegen, insbesondere kann die Zielsequenz mindestens ein Nukleotid stromaufwärts vom Starttriplett des kodierenden Bereichs der (m)RNA umfassen.

Bei einer in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ggf. als Wirkstoff enthaltenen dsRNA kann vorzugsweise ein modifiziertes Nukleotid auftreten. Der Begriff „modifiziertes Nukleotid" bedeutet erfindungsgemäß, dass das jeweilige Nukleotid chemisch modifiziert ist. Der Fachmann versteht unter dem Begriff „chemische Modifikation", dass das modifizierte Nukleotid durch Ersetzen, Anfügen oder Entfernen einzelner oder mehrerer Atome oder Atomgruppen im Vergleich zu natürlich vorkommenden Nukleotiden verändert ist. Mindestens ein modifiziertes Nukleotid in erfindungsgemäß verwendeter dsRNA dient einerseits der Stabilität und andererseits der Verhinderung der Dissoziation. Vorzugsweise sind zwischen 2 und 10, bevorzugt zwischen 2 und 5 Nukleotide in einer erfindungsgemäß verwendeten dsRNA modifiziert. Vorteilhafterweise ist mindestens eine 2'-Hydroxygruppe der Nukleotide der dsRNA in der doppelsträngigen Struktur durch eine chemische Gruppe, vorzugsweise eine 2'-Amino- oder eine 2'-Methylgruppe, ersetzt. Mindestens ein Nukleotid in mindestens einem Strang der doppelsträngigen Struktur kann auch ein sogenanntes „locked nucleotide" mit einem, vorzugsweise durch eine 2'-O, 4'-C-Methylenbrücke, chemisch modifizierten Zuckerring sein. Vorteilhafterweise sind mehrere Nukleotide der erfindungsgemäß verwendeten dsRNA „locked nucleotides". Darüber hinaus kann durch Modifizierung des Rückgrates einer erfindungsgemäß verwendeten dsRNA ein vorzeitiger Abbau derselben verhindert werden. Insbesondere bevorzugt ist in diesem Zusammenhang eine dsRNA, die in Form von Phosphorthioat, 2'-O-Methyl-RNA, LNA, LNA/DNA-Gapmeren, etc. modifiziert ist und daher eine längere Halbwertszeit in-vivo aufweist.

Vorzugsweise können die Enden der als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzten doppelsträngigen RNA (dsRNA) modifiziert werden, um einem Abbau in der Zelle oder einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegenzuwirken, insbesondere um einen vorzeitigen Abbau durch Nukleasen zu umgehen. Eine regelmäßig nicht gewünschte Dissoziation der Einzelstränge von dsRNA tritt insbesondere bei Verwendung niedriger Konzentrationen derselben oder kurzer Kettenlängen auf. Zur besonders wirksamen Hemmung der Dissoziation kann der durch die Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der doppelsträngigen Struktur von erfindungsgemäß verwendeter dsRNA durch mindestens eine, vorzugsweise mehr chemische Verknüpfung/en erhöht werden. Eine als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendete dsRNA, deren Dissoziation vermindert ist, weist eine höhere Stabilität gegen enzymatischen und chemischen Abbau in der Zelle bzw. im Organismus (in vivo) oder ex vivo auf und besitzt daher eine höhere Halbwertszeit. Eine weitere Möglichkeit zur Verhinderung frühzeitiger Dissoziation erfindungsgemäß verwendeter dsRNA in der Zelle besteht darin, dass an den Enden der Stränge jeweils Haarnadelschleife(n) ausgebildet sein können. In einer besonderen Ausführungsform weist eine in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendete dsRNA daher eine Haarnadelstruktur auf, um die Dissoziationskinetik zu verlangsamen. Bei einer derartigen Struktur ist vorzugsweise am 5'- und/oder 3'-Ende eine Loop-Struktur ausgebildet. Eine derartige Loop-Struktur weist keine Wasserstoffbrücken, typischerweise also keine Komplementarität, zwischen Nukleotidbasen auf. Typischerweise weist ein derartiger „Loop" eine Länge von mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7 Nukleotiden auf und verbindet auf diese Weise die beiden komplementären Einzelstränge einer erfindungsgemäß verwendeten dsRNA. Bevorzugt können ebenfalls die Nukleotide der beiden Stränge der erfindungsgemäß verwendeten dsRNA, um eine Dissoziation der Stränge zu verhindern, so modifiziert sein, dass eine Verstärkung der Wasserstoffbrückenbindung erreicht wird, bspw. durch Erhöhung der Wasserstoffbrückenbindungskapazität zwischen den Basen durch ggf. modifizierte Nukleotide. Dadurch wird die Stabilität der Wechselwirkung zwischen den Strängen erhöht und die dsRNA gegen einen Angriff von RNAsen geschützt.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die als Wirkstoff in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendete dsRNA gegen die (m)RNA eines wie zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens gerichtet. Vorzugsweise unterdrückt dabei die verwendete dsRNA die Translation eines zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens in einer Zelle mindestens zu 50%, stärker bevorzugt 60%, noch stärker bevorzugt 70%, und am stärksten bevorzugt zu mindestens 90%, d.h. die Zelle enthält vorzugsweise höchstens die Hälfte der nativ (ohne Behandlung mit erfindungsgemäß verwendeter dsRNA) auftretenden, zellulären Konzentration eines zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens. Die Suppression der Translation dieser Proteine oder Antigene in Zellen nach Zugabe erfindungsgemäß verwendeter dsRNA-Moleküle beruht auf dem durch solche Moleküle hervorgerufenen Phänomen der RNA-Interferenz. Bei der erfindungsgemäß verwendeten dsRNA handelt sich dann um sogenannte siRNA, die das Phänomen der RNA-Interferenz auslösen und die (m)RNA eines zuvor beschriebenen Proteins oder Antigens binden kann. Die Messung bzw. der Nachweis der durch die erfindungsgemäß verwendete dsRNA ausgelösten Translationssuppression in Zellen kann über Northern-Blot, quantitative Real-Time PCR oder auf Proteinebene mit spezifischen Antikörpern gegen eine zuvor beschriebenes Proteins oder Antigen erfolgen. Die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ggf. als Wirkstoff eingesetzte dsRNA sowie eine entsprechende siRNA kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden.

Zur weiteren Erhöhung der Immunogenität kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen oder mehrere Hilfsstoffe enthalten. Hierbei wird vorzugsweise eine synergistische Wirkung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) und eines gegebenenfalls zusätzlich in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen Hilfsstoffes und/oder ggf. eines wie oben beschriebenen Wirkstoffes erzielt. In Abhängigkeit der verschiedenen Arten von Hilfsstoffen können diesbezüglich verschiedene Mechanismen in Betracht kommen. Bspw. bilden Verbindungen, welche die Reifung von dendritischen Zellen (DC) erlauben, bspw. Lipopolysaccharide, TNF-α oder CD40-Ligand, eine erste Klasse geeigneter Hilfsstoffe. Allgemein kann jedes das Immunsystem beeinflussende Agenz von der Art eines "Gefahrsignals" (LPS, GP96 usw.) oder Cytokine, wie GM-CFS, als Hilfsstoff verwendet werden, welche es erlauben, eine durch das erfindungsgemäße immunstimulatorische Adjuvanz erzeugte Immunantwort zu verstärken und/oder gerichtet zu beeinflussen. Besonders bevorzugte Hilfsstoffe sind Cytokine, wie Monokine, Lymphokine, Interleukine oder Chemokine, z.B. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF-γ, INF-β, GM-CFS, M-CSF, G-CSF, LT-β, TNF-α, oder Interferone, bspw. IFN-γ, oder Wachstumsfaktoren, bspw. hGH.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann weiterhin zusätzlich ein im Stand der Technik bekanntes Adjuvanz enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließen wie oben beschriebene, im Stand der Technik bekannten Adjuvanzien mit ein.

Optional kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch geeigneten Träger enthalten. Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch geeigneter Träger" umfasst bevorzugt einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, bzw. Verdünnungsmittel oder einkapselnde Verbindungen, welche für die Verabreichung an eine Person geeignet sind. Der Begriff "kompatibel", wie hier verwendet, bedeutet, dass die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung in der Lage sind, mit dem Wirkstoff, dem Adjuvanz als solchem und miteinander in einer solchen Art zusammengemischt zu werden, dass keine Interaktion auftritt, welche wesentlich die pharmazeutische Effektivität der Zusammensetzung unter gewöhnlichen Verwendungsbedingungen reduzieren würde. Pharmazeutisch geeignete Träger müssen selbstverständlich eine ausreichend hohe Reinheit und eine ausreichend geringe Toxizität aufweisen, um sie für die Verabreichung an eine zu behandelnde Person geeignet zu machen. Einige Beispiele von Verbindungen, welche als pharmazeutisch geeignete Träger oder Bestandteile davon dienen können, sind Zucker, wie beispielsweise Lactose, Glucose und Sukrose; Stärken wie beispielsweise Kornstärke oder Kartoffelstärke; Cellulose und seine Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose, Celluloseacetat; pulverisiertes Tragacanth; Malz; Gelatine; Talg; feste Gleitmittel, wie beispielsweise Stearinsäure, Magnesiumstearat; Kalziumsulfat; vegetabile Öle, wie beispielsweise Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Kornöl und Öl aus Theobroma; Polyole, wie beispielsweise Polypropylenglycol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; Algininsäure; Emulgatoren, wie beispielsweise Tween®; Benetzungsmittel, wie beispielsweise Natriumlaurylsulfat; färbende Agenzien; geschmacksvermittelnde Agenzien, Arzneistoffträger; tablettenbildende Agenzien; Stabilisatoren; Antioxidantien; Konservierungsmittel; pyrogen-freies Wasser; isotonische Salzlösung und phosphatgepufferte Lösungen.

Die Wahl eines pharmazeutisch geeigneten Trägers wird grundsätzlich durch die Art bestimmt, durch die die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können bspw. systemisch verabreicht werden. Routen zur Verabreichung schließen z.B. transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen ein. Die geeignete Menge der zu verwendenen pharmazeutischen Zusammensetzung kann durch Routineexperimente mit Tiermodellen bestimmt werden. Solche Modelle schließen, ohne jedoch darauf begrenzt zu sein, Modelle von Kaninchen, Schaf, Maus, Ratte, Hund und nicht-humane Primatenmodelle mit ein. Bevorzugte Einheitsdosisformen zur Injektion schließen sterile Lösungen von Wasser, physiologischer Salzlösung oder Mischungen davon mit ein. Der pH solcher Lösungen sollte auf etwa 7,4 eingestellt werden. Geeignete Träger zur Injektion schließen Hydrogele, Vorrichtungen zur kontrollierten oder verzögerten Freigabe, polyfaktische Säure und Collagenmatrizen mit ein. Geeignete pharmazeutisch-geeignete Träger zur topischen Anwendung schließen solche mit ein, die zur Verwendung in Lotionen, Cremes, Gels u.ä. geeignet sind. Falls die Verbindung peroral verabreicht werden soll, sind Tabletten, Kapseln u.ä. die bevorzugte Einheitsdosisform. Die pharmazeutisch geeigneten Träger zur Herstellung von Einheitsdosisformen, die für die orale Verabreichung verwendbar sind, sind im Stand der Technik gut bekannt. Ihre Auswahl wird von sekundären Überlegungen wie Geschmack, Kosten und Lagerfähigkeit abhängen, welche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht kritisch sind, und ohne Schwierigkeiten durch einen Fachmann durchgeführt werden können.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung auch als Vakzine vorliegen. Erfindungsgemäße Vakzine umfassen dabei typischerweise eine Zusammensetzung wie zuvor für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, wobei die Zusammensetzung solcher erfindungsgemäßen Vakzine insbesondere durch die Art bestimmt wird, mit denen sie verabreicht werden. Bevorzugt werden erfindungsgemäße Vakzine systemisch verabreicht. Routen zur Verabreichung von solchen Vakzinen schließen typischerweise transdermale, orale, parenterale, einschließlich subkutane oder intravenöse Injektionen, topische und/oder intranasale Routen mit ein. Vakzine werden daher bevorzugt in flüssiger oder fester Form formuliert. Auch können ggf. in eine erfindungsgemäße Vakzine weitere Hilfsstoffe eingearbeitet sein, die die Immunogenität des Vakzins weiter steigern können. Vorteilhafterweise wird/werden ein oder mehr weitere solcher, wie zuvor definierte, Hilfsstoffe in Abhängigkeit der Immunogenität und anderen Eigenschaften des Wirkstoffes in der erfindungsgemäßen Vakzine zu wählen sein.

Gemäß einem weiteren bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, besonders bevorzugt die erfindungsgemäßen Vakzine, zur Behandlung von im folgenden genannten beispielhaften Indikationen verwendet. Mit erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, besonders bevorzugt erfindungsgemäßen Vakzinen, können beispielsweise solche Erkrankungen oder Zustände behandelt werden, die mit diversen pathologisch unterbleibenden Immunantworten verknüpft sind oder die eine Immunantwort, bevorzugt eine gesteigerte Immunantwort, im Rahmen einer Therapie erfordern, z.B. tumorspezifische oder pathogenspezifische Erkrankungen, Infektionserkrankungen, etc.. Die Erzeugung einer solchen Immunantwort bzw die Steigerung einer bereits vorhandenen, aber ggf. nicht ausreichenden Immunantwort durch die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung beruht dabei im wesentlichen auf dessen Fähigkeit, eine adjuvante, also nicht Antigen-spezifische Immunreaktion auszulösen. Ein wesentlicher Faktor für eine passende Immunantwort ist dabei die Stimulation unterschiedlicher T-Zell-Subpopulationen. T-Lymphozyten differenzieren typischerweise in zwei Subpopulationen, die T-Helfer 1 (Th1)- und T-Helfer 2 (Th2)-Zellen, mit denen das Immunsystem in der Lage ist, intrazelluläre (Th1) und extrazelluläre (Th2) Pathogene (z.B. Antigene) zu vernichten. Die beiden Th-Zellpopulationen unterscheiden sich im Muster der von ihnen produzierten Effektorproteine (Zytokine). So unterstützen Th1-Zellen die zelluläre Immunantwort durch Aktivierung von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen. Th2-Zellen fördern dagegen die humorale Immunantwort durch Stimulierung der B-Zellen zur Verwandlung in Plasmazellen und durch Bildung von Antikörpern (z.B. gegen Antigene). Von hoher Wichtigkeit ist bei der Immunantwort daher das Th1/Th2-Verhältnis. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird durch die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I), das Th1/Th2-Verhältnis der Immunantwort bevorzugt in Richtung der zellulären Antwort, d.h. der Th1-Antwort, verschoben und damit eine überwiegend zelluläre Immunantwort induziert. Erst durch diese Verschiebung und dem präferentiellen, falls nicht sogar aussschließlichen, Auftreten einer TH1-Immunantwort wird eine effiziente Behandlung der o.g. Indikationen ermöglicht. Bevorzugt werden daher vorliegend erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen oder Vakzine eingesetzt, um tumorspezifische oder pathogenspezifische Immunantworten auszulösen. Besonders bevorzugt können solche erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Vakzine, zur Steigerung von Immunantworten antigenpräsentierender Zellen (APC) verwendet werden. Ebenfalls besonders bevorzugt können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Vakzine zur Behandlung von Krebs bzw. Tumorerkrankungen eingesetzt werden, bevorzugt ausgewählt aus Kolonkarzinomen, Melanomen, Nierenkarzinomen, Lymphomen, akuter myeloider Leukämie (AML), akuter lymphoider Leukämie (ALL), chronischer myeloider Leukämie (CML), chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL), Gastrointestinalen Tumoren, Lungenkarzinomen, Gliomen, Schilddrüsentumoren, Mammakarzinomen, Prostatatumoren, Hepatomen, diversen virus-induzierten Tumoren wie z. B. Papillomvirus-induzierten Karzinomen (z. B. Cervixkarzinome), Adenokarzinomen, Herpesviren-induzierten Tumoren (z.B. Burkitt's Lymphom, EBV-induziertes B Zelllymphome), Hepatitis B-induzierten Tumoren (Hepatozellkarzinome), HTLV-1 und HTLV-2 induzierten Lymphomen, Akustikusneurinomen, Gebärmuttehalskrebs, Lungenkrebs, Rachenkrebs, Analkarzinomen, Glioblastomen, Lymphomen, Rektumkarzinomen, Astrozytomen, Hirntumoren, Magenkrebs, Retinoblastomen, Basaliomen, Hirnmetastasen, Medulloblastomen, Scheidenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hodenkrebs, Melanomen, Schilddrüsenkarzinomen, Blasenkrebs, Hodgkin-Syndrom, Meningeomen, Schneeberger Krankheit, Bronchialkarzinomen, Hypophysentumor, Mycosis fungoides, Speiseröhrenkrebs, Brustkrebs, Karzinoide, Neurinomen, Spinaliomen, Kurkitt-Lymphomen, Kehlkopfkrebs, Nierenkrebs, Thymomen, Corpuskarzinomen, Knochenkrebs, Non-Hodgkin-Lymphomen, Urethrakrebs, CUP-Sysndrom, Kopf-Hals-Tumoren, Oligodendrogliomen, Vulvakrebs, Darmkrebs, Kolonkarzinomen, Ösphaguskarzinomen, Warzenbeteiligung, Dünndarmtumoren, Kran iopharyngeomen, Ovarial-Karzinomen, Weichteiltumoren, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Pankreaskarzinomen, Zervixkarzinomen, Endometriumkarzinomen, Lebermetastasen, Peniskrebs, Zungenkrebs, Gallenblasenkrebs, Leukämie, Plasmozytomen, Gebärmutterkrebs, Lidtumor, Prostatakrebs, etc.. In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, wenn als Lipid in der Lipid-modifizierten-Nukleinsäure oder als Wirkstoff α-Tocopherol (Vitamin E), D-α-Tocopherol, L-α-Tocopherol, D,L-α-Tocopherol oder Vitamin E-Succinat (VES) eingesetzt werden. α-Tocopherol (Vitamin E) ist wenig toxisch und zeigt eine potente Antitumor-Wirkung (A. Bendich, L. J. Machlin Am. J. Clin. Nutr. 48 (1988) 612), was dessen in der Krebstherapie vielversprechend erscheinen lässt. Als Erklärung für die Inhibierung der Proliferation von Tumorzellen bzw. der zytotoxischen Wirkung auf sie sind v.a. zwei Mechanismen bekannt: Zum einen ist Vitamin E ein potentes Antioxidanz und ein guter Radikalfänger (C. Borek Ann. NY Acad. Sci. 570 (1990) 417), zum anderen kann es über eine Stimulierung der Immunantwort das Tumorwachstum verhindern (G. Shklar, J. Schwartz, D. P. Trickler, S. Reid J. Oral Pathol. Med. 19 (1990) 60). In neueren Arbeiten wurde weiterhin ein Zusammenhang zwischen der Expression des Tumorsuppressorgens p53 in Tumorzellen (oral squamous cancer und einer Behandlung mit Vitamin E-Succinat (VES) gefunden (J. Schwartz, G. Shklar, D. Trickler Oral Oncol. Europ. J. Cancer 29B (1993) 313). Dabei konnte sowohl eine Stimulierung der Produktion des wild type p53, welches als Tumorsuppressor gilt, beobachtet werden, als auch eine Reduktion von mutiertem p53, das onkogene Wirkung entfaltet. Interessanterweise ist die biologische Wirkung von VES auf diese Tumorzellen in zweifacher Hinsicht dosisabhängig: In physiologischen Dosen (0,001–50 μmol/l) ist ein ansteigendes Zellwachstum zu beobachten, in pharmakologischen Dosen (100–154 μmol/l) wird das Zellwachstum inhibiert. Dies wurde in Zellkultur gezeigt (T. M. A. Elattar, A. S. Virji Anticancer Res. 19 (1999) 365). Auch konnte in verschiedenen Brustkrebszelllinien durch Behandlung mit VES Apoptose induziert werden (W. Yu, K. Israel, Q. Y. Liao, C. M. Aldaz, B. G. Sanders, K. Kline Cancer Res. 59 (1999) 953). Die induzierte Apoptose wird dabei über eine Interaktion von Fas-Ligand und Fas-Rezeptor eingeleitet. Dies ist deshalb besonders hervorzuheben, weil bei den entsprechenden Zelllinien ein derartiger Mechanismus bisher nicht beobachtet werden konnte. Von Vitamin E existieren verschiedene Isomere, die sich in der Anzahl und Position der Methylgruppen am aromatischen Ring unterscheiden. In den beschriebenen Arbeiten wurde die biologisch wirksamste Form des natürlich vorkommenden Vitamin E, das α-Tocopherol, eingesetzt. Dieses kommt wiederum in verschiedenen Stereoisomeren vor, da das Molekül drei optisch aktive Zentren enthält. Die natürliche Form des Vitamin E ist das RRR-α-Tocopherol (früher D-α-Tocopherol), allerdings wird heutzutage überwiegend das Racemat (D,L-α-Tocopherol) eingesetzt. Alle hier zuvor genannten Formen von Vitamin E sind ebenfalls als Lipid im Sinne der vorliegenden Erfindung mit umfasst.

Ebenfalls besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Infektionserkrankungen eingesetzt. Ohne darauf beschränkt zu sein werden solche Infektionskrankheiten bevorzugt ausgewählt aus Influenza, Malaria, SARS, Gelbfieber, AIDS, Lyme-Borreliose, Leischmaniasis, Anthrax, Meningitis, viralen Infektionskrankheiten wie AIDS, Condyloma acuminata, Dellwarze, Dengue-Fieber, Dreitagefieber, Ebolavirus, Erkältung, Frühsommermeningoenzephalitis (FSME), Grippe, Gürtelrose, Hepatitis, Herpes-Simplex Typ I, Herpes-Simplex Typ II, Herpes zoster, Influenza, Japanische Enzephalitis, Lassafieber, Marburg-Virus, Masern, Maul- und Klausenseuche, Mononukleose, Mumps, Norwalk-Virus-infektion, Pfeifersches-Drüsenfieber, Pocken, Polio (Kinderlähmung), Pseudokrupp, Ringelröteln, Tollwut, Warzen, West-Nil-Fieber, Windpocken, Zytomegalie-Virus (CMV), aus bakteriellen Infektionskrankheiten wie Abort (Prostataentzündung), Anthrax, Appendizitis (Blinddarmentzündung), Borreliose, Botulismus, Camphylobacter, Chlamydia trachomatis (Harnröhren-, Bindehautentzündung), Cholera, Diphterie, Diphterie, Donavanosis, Epiglottitis, Fleckfieber, Flecktyphys, Gasbrand, Gonorhoe, Hasenpest, Heliobakter pylori, Keuchhusten, klimatischer Bubo, Knochenmarksentzündung, Legionärskrankheit, Lepra, Listeriose, Iungenentzündung, Meningitis, Bakterielle Gehirnhautentzündung, Milzbrand, Mittelohrentzündung, Mycoplasma hominis, Neugeborenensepsis (Chorioamnionitis), Noma, Paratyphus, Pest, Reitersyndrom, Rocky Mountain spotted fever, Salmonellen-Paratyphus, Salmonellen-Typhus, Scharlach, Syphilis, Tetanus, Tripper, Tsutsugamushi, Tuberkulose, Typhus, Vaginitis (Kolpitis), Weicher Schanker und aus durch Parasiten, Protozoen oder Pilze hervorgerufenen Inkektionskrankheiten wie Amöbenruhr, Bilharziose, Chagas-Krankheit, Fußpilz, Kleienpilzflechte, Krätze (Skabies), Malaria, Onchozerkose (Flussblindheit), oder Pilzerkrankungen, Toxoplasmose, Trichomoniasis, Trypanosomiasis (Schlafkrankheit), Viszerale Leishmaniose, Windeldermatitis, Schistosomiasis, Fischvergiftung (Ciguatera), Kandiose, Kutane Leishmaniose, Lamblienruhr (Giadiasis), oder Schlafkrankheit, oder aus Infektionskrankheiten hervorgerufen durch Echinococcus, Fischbandwurm, Fuchsbandwurm, Hundebandwurm, Läuse, Rinderbandwurm, Schweinebandwurm, Zwergbandwurm.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I), wie oben beschrieben, zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines erfindungsgemäßen Vakzins zur Behandlung von zuvor beschriebene Indikationen, z.B. zur Behandlung von den genannten Tumor- bzw. Infektionserkrankungen. Alternativ umfasst die Erfindung die (therapeutische) Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) zur Behandlung von Tumor- oder Infektionserkrankungen, wie zuvor beschrieben.

Ebenfalls umfasst werden von der vorliegenden Erfindung Kits, enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure der Formel (I) und/oder eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung und/oder eine erfindungsgemäße Vakzine sowie optional eine technische Gebrauchsanweisung mit Angaben zur Verabreichung und Dosierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I) und/oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder der erfindungsgemäßen Vakzine.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Beispielen weiter illustriert, ohne dass diese dazu gedacht sind, die Gegenstände der vorliegenden Erfindung hierauf zu beschränken.

Figurenbeschreibung:

1: zeigt die Stimulierung von Maus-BMDCs (bone marrow dendritic cells) mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der SEQ ID NOs: 1 und 2. Am deutlichsten lässt sich bei SEQ ID NO: 1 eine Stimulierung beobachten. Gemessen wurde die Ausschüttung von IL-6 und IL-12 (ng/ml) als Maß der Immunstimulierung (vgl. Beipiel 2). Als Positivkontrolle wurde dabei die immunstimulierende ungecappte Wildtyp-mRNA von beta-Galactosidase (lacZ), komplexiert mit Protamin, verwendet.

2: zeigt die Stimulierung von humanen PBMCs (hPBMCs) mit erfindungsgemäßen Oligonukleotiden der SEQ ID NOs: 1 und 2. Am deutlichsten lässt sich bei SEQ ID NO: 1 eine Stimulierung beobachten. Gemessen wurde die Ausschüttung von Interleukin-6 (IL-6) und TNF alpha (ng/ml) als Maß der Immunstimulierung (vgl. Beipiel 2).

3: zeigt die Stimulierung von humanen PBMCs (hPBMCs) mit erfindungsgemäßen Oligonukleotiden der SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 und 5. Am deutlichsten lässt sich bei SEQ ID NO: 1 eine Stimulierung beobachten. Gemessen wurde die Ausschüttung von Interleukin-6 (IL-6) (ng/ml) als Maß der Immunstimulierung (vgl. Beipiel 2).

4: zeigt verschiedene erfindungsgemäße Möglichkeiten der Endmodifizierung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I) mit Lipiden. Dargestellt sind insbesondere die Lipid-modifizierten Linker bzw. bifunktionellen Peptide, die zur Kopplung bzw. Synthese mit Nukleinsäuresequenzen (kurz: ODN-Sequenz) verwendet werden können.

5: beschreibt beispielhaft einen Syntheseweg für (trifunktionale) Lipid-modifizierte Linker, mit der z.B. eine Tocopherolmodifizierung an das 3'-Ende einer Nukleinsäure eingebracht werden kann. Solche beispielhaft dargestellten Verbindungen stellen ein Zwischenprodukt bei der Herstellung der erfindungsgemäßen 5'- oder 3'-Lipid-modifizierten Nukleinsäuren sowie der erfindungsgemäßen Adjuvanzien dar.

6: zeigt beispielhaft ein bifunktionelles Lipid mit einem Succinylanker, das eine 3'-Modifizierung einer Nukleinsäure mit einem bifunktionellen Lipid, z.B. mit PEG, ermöglicht.

7: stellt schematisch die Kopplung von Lipid-modifizierten Amiditen an das 5'-Ende von Nukleinsäuren dar.

Beispiele:1. Synthese von beispielhaften erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I)

RNA-Oligonukleotide als Beispiele der erfindungsgemäßen Nukleinsäure der allgemeinen Formel (I) GlXmGn (SEQ ID NO: 1–77) wurden automatisiert festphasensynthetisch mittels Phosphoramiditchemie hergestellt. Dabei wurden jeweils die RNA-spezifischen 2'-Hydroxylgruppen der Nukleotide mit TBDMS-Schutzgruppen geschützt. Bei der Synthese von Phosphorthioaten wurde zur Oxidation Beaucage-Reagenz eingesetzt. Die Abspaltung vom Trägermaterial sowie der basenlabilen Schutzgruppen wurde mit Methylamin durchgeführt, die Abspaltung der TBDMS-Schutzgruppe mit Triethylamintrihydrofluorid.

Das jeweilige Rohprodukt wurde mit HPLC entweder mit Ionenpaarchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, oder einer Kombination beider Methoden aufgereinigt, entsalzt und getrocknet. Massenspektrometrisch wurde das Produkt auf Reinheit und korrekte Rasenzusammensetzung untersucht.

2. In vitro-Immunstimulation mit beispielhaften erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I)

  • a) Zur Stimulierung von Maus-BDMCs (bone marrow derived dendritic cells) wurden 3 μl Oligofectamin mit 30 μl FCS-freiem IMDM-Medium gemischt (Fa. BioWhittaker, Katalog-Nr BE12-722F), bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert, 6 μg der als RNA vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I) gemäß SEQ ID NOs: 1–2, wurden mit 60 μl FCS-freiem IMDM gemischt und mit Oligofectamin/IMDM gemischt, für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 33 μl dieser Mischung zur Kultivierung über Nacht in eine Kammer einer Mikrotiter-Kulturplatte mit 96 Kammern gegeben, die 200.000 Maus-BDMCs in 200 μl FCS-freiem IMDM-Medium enthielt. Nach 4 Stunden wurden 100 l IMDM mit 20% FCS zugefügt und nach 16 Stunden Ko-inkubation wurde der Überstand abgenommen und auf Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-12 (IL-12) durch einen Cytokin-ELISA getestet. Vergleichsversuche wurden analog zu den erfindungsgemäßen Sequenzen SEQ ID NO: 1 und 2 mit der immunstimulierenden ungecappten Wildtyp-mRNA von beta-Galactosidase (lacZ), komplexiert mit Protamin, durchgeführt.
    Es konnte gezeigt werden, dass die als RNA vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I), insbesondere der erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß den SEQ ID NOs: 1 und 2, gute immunstimulatorische Eigenschaften aufwiesen. Insbesondere zeigte SEQ ID NO: 1 eine wesentlich über die stimulatorischen Eigenschaften der zu Vergleichszwecken herangezogenen immunstimulierenden ungecappten Wildtyp-mRNA der beta-Galactosidase (lacZ) hinausgehende Immunstimulation.
  • b) Humane PBMCs wurden über einen FicoII-Dichtegradienten und Kultivierung über Nacht in X-VIVO-15-Medium (Fa. BioWhittaker, Katalog-Nr. BE04-418Q) erhalten, das 1% Glutamin und 1% Penicillin in Gegenwart von 10 μ/ml der als RNA vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I), insbesondere der erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und 2 (vgl. 2) bzw. gemäß SEQ ID NO: 1–5 (vgl. 3), enthielt.
    Zur Stimulierung wurden 3 μl Oligofectamin mit 30 μl X-VIVO-15-Medium (Fa. BioWhittaker, Katalog-Nr. BE04-418Q) gemischt, bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. 6 μg der als RNA vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I), insbesondere der erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und 2 (vgl. 2) bzw. gemäß SEQ ID NO: 1–5 (vgl. 3), wurden mit 60 μl X-VIVO-15-Medium (Fa. BioWhittaker, Katalog-Nr. BE04-418Q) gemischt und mit Oligofectamin/X-VIVO-Medium gemischt, für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 33 μl dieser Mischung zur Kultivierung über Nacht in eine Kammer einer Mikrotiter-Kulturplatte mit 96 Kammern gegeben, die 200.000 PBMCs in 200 μl X-VIVO-15-Medium (Fa. BioWhittaker, Katalog-Nr. BE04-418Q) enthielt. Nach 16 Stunden Ko-inkubation wurde der Überstand abgenommen und auf Interleukin-6 (IL-6) und Interleukin-12 (IL-12) und TNFα durch einen Cytokin-ELISA getestet. Vergleichsversuche wurden analog zu den erfindungsgemäßen Sequenzen SEQ ID NO: 1 und 2 mit dem immunstimulierenden Oligo RNA40 (5'-GCCCGUCUGUUGUGUGACUC-3', SEQ ID NO: 80) durchgeführt.
    Es konnte gezeigt werden, dass die als RNA vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Formel (I), insbesondere der erfindungsgemäßen Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 und 2 (vgl. 2) bzw. gemäß SEQ ID NO: 1–5 (vgl. 3), gute immunstimulatorische Eigenschaften aufwiesen. Insbesondere zeigte SEQ ID NO: 1 eine wesentlich über die stimulatorischen Eigenschaften des zu Vergleichszwecken herangezogenen RNA-Oligonukleotids hinausgehende Immunstimulation.

3. In vivo-Immunstimulation mit beispielhaften erfindungsgemäßen Nukleinsäuren des Formel (I) – Verwendung als Adjuvanz

BALB/c-Mäusen (5 pro Gruppe) wurde β-Galaktosidase-Protein und ein Adjuvanz (siehe Tabelle 1) an den Tagen 0 und 10 injiziert. Die Mäuse wurden an Tag 20 getötet und das Blutserum wurde für einen Antikörpertest gegen β-Galaktosidase-Protein mit ELISA verwendet und analog zu oben beschriebenen in vitro-Kulturen eine Bestimmung der IL-6, IL-12 bzw. TNF-α Werte durchgeführt.

4. Synthese von 1-(4,4'-Dimethoxytrityl)-polyethylenglykol (DMT-PEG1500)

Arbeitsvorschrift: 21 g PEG1500 (14 mmol) werden zur Trocknung zwei mal in je 30 ml absolutem Pyridin gelöst, das anschließend azeotrop abdestilliert wird. Das getrocknete Edukt wird in 35 ml abs. Pyridin gelöst. Zu dieser Lösung wird über einen Zeitraum von 30 min 4,7 g 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (13,9 mmol) gelöst in 35 ml abs. Pyridin zugetropft. Es werden weitere 2 h bei RT gerührt, dabei wird der Reaktionsverlauf mittels DC kontrolliert. Neben des Nachweises der DMT-Gruppe mittels UV-Lampe können die DC-Platten in zwei Schritten entwickelt werden: 1. In HCl-gesättigter Atmosphäre zum Nachweis von DMT; 2. In der Iodkammer zum Nachweis von PEG; PEG kann außerdem mit Dragendorff-Bürger-Sprühreagenz nachgewiesen werden. Nach Beendigung der Reaktion wird das Lösungsmittel entfernt und das Produkt in 50 ml DCM aufgenommen. Die organische Phase wird zwei mal mit je 25 ml 5% NaHCO3-Lösung sowie zwei mal mit je 25 ml H2O gewaschen. Die Phasentrennung zwischen wässriger und organischer Phase ist dabei langwierig, da PEG sowohl hydrophoben als auch hydrophilen Charakter besitzt. Nach Trocknen über Na2SO4 wird das Lösungsmittel entfernt und das Rohprodukt säulenchromatographisch über Kieselgel mit DCM/MeOH/TEA = 18:2:0,5 gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen werden mittels DC identifiziert, vereinigt und zur Trockene eingeengt. Man erhält ein gelbliches Öl, das nach gutem Trocknen im Hochvakuum zu einem wachsartigen Feststoff wird.
Ausbeute: 18,3 g (72,5% der Theorie)
DC (DCM/MeOH/TEA = 18:2:0,5): Rf-Wert 0,55 (durch die Molmassenverteilung von PEG verbreitertes Signal)

5. Synthese von 1-(4,4'-Dimethoxytrityl)-hexaethylenglykol (DMT-HEG)

Arbeitsvorschrift: 10 g Hexaethylenglykol (35 mmol) werden durch Coevaporation mit zwei mal je 30 ml abs. Pyridin getrocknet und anschließend in 20 ml abs. Pyridin gelöst. Analog zur Vorschrift in Beispiel 1 wird das HEG mit 10 g DMT-Cl (29,5 mmol) gelöst in 50 ml abs. Pyridin umgesetzt. Die säulenchromatographische Aufreinigung erfolgt mit Ethylacetat/TEA = 95:5. Als getrocknetes Produkt erhält man ein zähes, gelbes Öl.
Ausbeute: 12,5 g (60,5% der Theorie)
DC (DCM/MeOH = 95:5): Rf-Wert = 0,59
MS (FD): m/z 583,9 (M+)
1H-NMR (CDCl3): δ 3,21 (t, DMT-O-CH2-), 3,47–3,68 (m, -CH2-), 3,76 (s, -CH3), 6,77–7,46 (m, Aromaten)

6. Synthese von 1-(4,4'-Dimethoxytrityl)-polyethylenglykolsuccinat (DMT-PEG-Suc)

Nachstehende Arbeitsvorschrift ist sowohl für DMT-PEG1500 als auch für DMT-HEG anwendbar.

Arbeitsvorschrift: 5 g DMT-PEG1500 (2,8 mmol) werden in 25 ml DCM/Pyridin = 5:1 gelöst und mit 420 mg Bernsteinsäureanhydrid (4,2 mmol, d.h. 1,5 eq) gelöst in 7 ml Pyridin sowie mit 170 mg DMAP (1,4 mmol, d.h. 0,5 eq) gelöst in 3 ml Pyridin versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT werden die Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der Rückstand in DCM aufgenommen. Die organische Phase wird gründlich drei Mal mit NaHCO3-Lösung (10% in H2O) und zwei Mal mit gesättigter wässriger NaCl-Lösung gewaschen, um die überschüssige Bernsteinsäure abzutrennen. Nach Trocknen über Na2SO4 wird das Lösungsmittel entfernt. Die Succinate können nach gründlicher Trocknung am Hochvakuum ohne weitere Aufarbeitung zur Kupplung auf aminomodifizierten Trägermaterialien eingesetzt werden.
DC: DMT-PEG1500-Suc (DCM/MeOH/TEA = 18:2:0,5): Rf-Wert = 0,41
DMT-HEG-Suc (DCM/MeOH = 9:2): Rf-Wert = 0,70

7. Synthese von 1-Tosyl-2,3-isopropylidenglycerol

Arbeitsvorschrift: 200 mmol Isopropylidenglycerol (26,4 g) werden in 200 ml Acetonitril gelöst und mit 22,2 g Triethylamin (220 mmol) versetzt. 220 mmol p-Toluolsulfonsäurechlorid (41,9 g) werden in 250 ml Acetonitril gelöst und unter Rühren über 2 h zum Reaktionsgemisch zugetropft. Man lässt weitere 20 h bei RT rühren, wobei ein weißer Niederschlag ausfällt, welcher nach Beendigung der Reaktion abfiltriert wird. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Rohprodukt über Kieselgel säulenchromatographisch mit n-Hexan/Ethylacetat = 2:1 aufgereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen werden mittels DC identifiziert, vereinigt und zur Trockene eingeengt. Das Produkt wird am Hochvakuum getrocknet. Es resultiert ein gelbliches Öl (L. N. Markovskii et al. J. Org. Chem. UdSSR 26 (1990) 2094.).
Ausbeute: 31,3 g (54,7% der Theorie)
DC (n-Hexan/Ethylacetat = 2:1): Rf-Wert = 0,2
MS (FD): m/z 272,0 (M+-CH) (286,3 berechnet)
1H-NMR (CDCl3): δ 1,31 (s); 1,34 (s); 2,45 (s); 3,74–3,79 (m); 3,90–4,08 (m); 4,23–4,32 (m); 7,36 (d); 7,77 (d)
13C-NMR: δ 21,7; 25,2; 26,7 (Methyl-C); 66,2; 69,5; 72,9 (Glycerin-C); 110,1 (Methylen-C); 128,0; 129,9; 132,7; 145,1 (Aromaten-C)

8. Synthese von 2,3-Isopropyliden-1-D,L-α-tocopherolglycerol (Toc1)

Arbeitsvorschrift: Zu 56 mmol D,L-α-Tocopherol (24,06 g) in 280 ml DMSO werden 5,6 g pulverisiertes Kaliumhydroxid (100 mmol) zugegeben. Nach 2 h Rühren bei RT unter Lichtausschluss werden 56 mmol 1-Tosyl-2,3-isopropylidenglycerol (16 g) gelöst in 20 ml DMSO zugetropft und weitere 12 h bei 60°C gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch auf 1 l Eiswasser hydrolysiert und die wässrige Phase mit 1,5 l Toluol extrahiert. Nachdem über Natriumsulfat getrocknet wurde, wird das Lösungsmittel entfernt. Das Rohprodukt wird über Kieselgel säulenchromatographisch mit n-Hexan/Ethylacetat = 1:1 aufgereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen werden mittels DC identifiziert, vereinigt und zur Trockene eingeengt. Das Produkt wird im Hochvakuum getrocknet und unter Lichtausschluss aufbewahrt. Es resultiert ein gelbliches Öl (D. W. Will, T. Brown Tetrahedron Lett. 33 (1992) 2729.).
Ausbeute: 24,2 g (79,2% der Theorie)
DC (n-Hexan/Ethylacetat = 1:1): Rf-Wert = 0,69
MS (FD): m/z 544,6 (M+)

9. Synthese von 1-D,L-α-Tocopherylglycerol (Toc2)

Arbeitsvorschrift: 16,9 mmol Toc1 (9,2 g) werden in 100 ml HCl(2 M)/THF (1:1) gelöst und 2 h bei RT unter Lichtausschluss gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel entfernt, der Rückstand zweimal mit je 50 ml absolutem Ethanol versetzt und das Gemisch wieder zur Trockene eingeengt. Das Rohprodukt wird mit Diethylether/Toluol = 1:1 über Kieselgel säulenchromatographisch aufgereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen werden mit DC identifiziert, vereinigt und zur Trockene eingeengt. Das Produkt wird am Hochvakuum getrocknet und unter Lichtausschluss aufbewahrt. Es resultiert ein gelbes Öl.
Ausbeute: 6,6 g (77,5% der Theorie)
DC (Diethylether/Toluol = 1:1): Rf-Wert = 0,22
MS (FD): m/z 504,4 (M+)

10. Synthese von [1-(4,4'-Dimethoxytrityl)]-3-D,L-α-tocopherylglycerol (Toc3)

Arbeitsvorschrift: 6,6 g Toc2 (13 mmol) werden zum Trocknen zweimal in 15 ml absolutem Pyridin gelöst, das wieder azeotrop abdestilliert wird. Das getrocknete Edukt wird in 50 ml absolutem Pyridin gelöst und mit 5,34 g DMT-Cl (15,8 mmol) versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT unter Lichtausschluss wird die Reaktion durch die Zugabe von 50 ml Methanol beendet und das Reaktionsgemisch zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 500 ml Dichlormethan aufgenommen und zwei Mal mit je 150 ml wässriger, gesättigter NaCl-Lösung und anschließend einmal mit 150 ml Wasser gewaschen. Nachdem über Na2SO4 getrocknet wurde, wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand säulenchromatographisch über Kieselgel gereinigt (n-Hexan/Diethylether/Triethylamin = 40:60:1). Die produkthaltigen Fraktionen werden mittels DC identifiziert, vereinigt und zur Trockene eingeengt. Das Produkt wird am Hochvakuum getrocknet. Es resultiert ein gelbliches Öl, das unter Lichtausschluss aufbewahrt wird.
Ausbeute: 8,5 g (81% der Theorie)
DC (n-Hexan/Diethylether/TEA = 40:60:1): Rf-Wert = 0,43
MS (FD): m/z 807,2

11. Synthese von [1-(4,4'-Dimethoxytrityl)]-2-succinyl-3-D,L-α-tocopherylglycerol (Toc4)

Arbeitsvorschrift: 1,45 g Toc3 (1,8 mmol) werden zur Trocknung zweimal in je 5 ml abs. Pyridin gelöst, das wieder azeotrop abdestilliert wird. Nachdem das Edukt in 8 ml abs. Pyridin gelöst wurde, gibt man im Argongegenstrom 140 mg DMAP (1,08 mmol) und 194,4 mg Bernsteinsäureanhydrid (1,8 mmol) zu. Anschließend wird 18 h unter Lichtausschluss bei RT gerührt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung mit 45 ml DCM versetzt und vier Mal mit je 50 ml Wasser gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel entfernt und das Rohprodukt säulenchromatographisch über Kieselgel mit Ethylacetat/Methanol/NH3 (25% in H2O) = 5:1:1 gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen werden mittels DC identifiziert, vereinigt und zur Trockene eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum resultiert ein bräunliches, zähes Öl, das gekühlt und unter Lichtausschluss aufbewahrt wird.
Ausbeute: 1,35 g (82,8% der Theorie)
DC (EtOAc/NH3/MeOH = 5:1:1): Rf-Wert = 0,30
MS (FD): m/z 906,2 (M+), 604,2 (M+-DMT)

12. Synthese von D,L-α-Tocopheryl-β-cyanoethyl-N,N-diisopropyl-phosphoramidit

Arbeitsvorschrift: 5 g D,L-α-Tocopherol (11,6 mmol) werden zwei Mal mit je 25 ml Pyridin versetzt und durch azeotropes Schleppen getrocknet. Das Edukt wird in 40 ml DCMabs gelöst. Im Argongegenstrom werden 7,9 ml DIPEAabs (46,4 mmol) und 2,5 ml 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphinchlorid (11 mmol) langsam zugetropft. Nachdem das Reaktionsgemisch 1 h bei RT unter Lichtausschluss gerührt hat, wird es mit 100 ml Ethylacetat/TEA (20:1) verdünnt und zwei Mal mit 25 ml 10% NaHCO3 sowie zwei Mal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Anschließend wird die organische Phase über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel am Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird über Kieselgel säulenchromatographisch mit Ethylacetat gereinigt.
Ausbeute: 5,62 g (81% der Theorie)
DC (EtOAc): Rf-Wert = 0,75
MS (FD): m/z 630,1 (M+)
31P-NMR: 152,24

13. Synthese von [1-(4,4'-Dimethoxytrityl)]-(3-D,L-α-tocopheryl)-glycerol-2-phosphoramidit

Arbeitsvorschrift 1 g Toc3 (1,24 mmol) wird zur Trocknung zwei Mal in je 10 ml abs. Pyridin gelöst, das wieder azeotrop abdestilliert wird. Anschließend löst man das Edukt in 20 ml DCMabs und tropft im Argongegenstrom 0,84 ml DIPEAabs (4,96 mmol) zu. Danach werden 0,27 ml 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphinchlorid (1,19 mmol) im Argongegenstrom langsam zugetropft. Man lässt das Reaktionsgemisch 1 h bei RT rühren, bevor die Lösung mit 50 ml Ethylacetat/TEA (20:1) verdünnt wird. Die organische Phase wird zwei Mal mit 15 ml einer 10%igen NaHCO3-Lösung und zwei Mal mit einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen und anschließend über Na2SO, getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Rohprodukt säulenchromatographisch über Kieselgel mit Ethylacetat/TEA (99:1) gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen werden mittels DC identifiziert, vereinigt und zur Trockene eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum resultiert ein gelbbräunliches, sehr zähes Öl, das gekühlt und unter Lichtausschluss aufbewahrt wird.
Ausbeute: 0,76g (63,4% der Theorie)
DC (EtOAc, 1% TEA): Rf-Wert = 0,68
MS (FD): m/z 1006,4 (M+), 953,6 (M+-Cyanoethyl), 651,4 (M+-DMT,-Cyanoethyl), 603,1 (M+-DMT,-diisopropylamin), 303,1 (DMT+)
31P-NMR: 150,5

14. Synthese von 1-Hexadecyl-2,3-isopropylidenglycerol (Pam1)

Arbeitsvorschrift: Zu 0,1 mol D,L-,-Isopropyliden-Glycerin (12,4 ml) in 500 ml THFabs werden portionsweise unter Argongegenstrom 0,11 mol Natriumhydrid (2,42 g) zugegeben. Nach 12 h Rühren bei RT wird zu dem entstandenen Alkoholat 0,11 mol 1-Bromhexadecan (33,6 ml) in 80 ml THFabs zugetropft. Nach Zugabe von 0,5 mmol Tetrabutylammoniumiodid als Katalysator wird 12 h zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen des Reaktionsgemisches wird das entstandene Natriumbromid abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in Diethylether aufgenommen und die Etherphase drei Mal mit H2O ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der organischen Phase über Na2SO4 wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand über Kieselgel säulenchromatographisch (EtOAc/n-Hexan = 1:9) gereinigt (S. Czernecki, C. Georgoulis, C. Provelenghiou Tetrahedron Lett. 39 (1976) 3535).
Ausbeute: 18,5 g (52% der Theorie)
DC (EtOAc/n-Hexan = 1:9): Rf-Wert = 0,47
MS (FD): m/z 357,6 (M+ + 1)
1H-NMR (CDCl3): 0,80 (t), 1,18 (s), 1,35 (s), 1,37 (s), 3,30–3,48 (m), 3,63–3,69 (dd), 3,96–4,01 (dd), 4,19 (q)
13C-NMR (CDCl3): 14,1; 22,7; 25,4; 26,1; 26,8; 29,4; 29,6; 29,7; 31,9 (Alkylkette), 67,0 (Alkyl-C-O-), 71,8; 71,9; 74,7 (Glycerin-C), 109,3 (Ketyl-C)

15. Synthese von 1-Hexadecylglycerol (Pam2)

Arbeitsvorschrift: 18,5 g Pam1 (52 mmol) werden in 300 ml Essigsäure (65%) 24 h bei 40°C gerührt. Der weiße Niederschlag wird abfiltriert und mehrfach mit n-Hexan zur Trockene eingeengt. Zur Reinigung wird das Produkt dreimal mit n-Hexan aufgeschlämmt und abfiltriert. Nicht entschütztes Edukt ist im Gegensatz zum Produkt in n-Hexan löslich und kann somit abgetrennt werden. Der verbleibende Rückstand wird im Vakuum getrocknet. Die vereinigten Filtrate werden ebenfalls zur Trockene eingeengt und erneut der Abspaltprozedur unterzogen (H. Paulsen, E. Meinjohanns, F. Reck, I. Brockhausen Liebigs Ann. Chem. (1993) 721). Ausbeute: 14,6 g (88% der Theorie)
DC (EtOAc/n-Hexan = 1:1): Rf-Wert = 0,2
MS (FD): m/z 317,4 (M+ + 1)
1H-NMR (CDCl3): 0,86 (t), 1,23 (s), 3,30–3,48 (m), 3,41–3,49 (m), 3,55–3,75 (m), 3,78–3,9 (m)
13C-NMR (CDCl3): 14,1; 22,7; 25,4; 26,1; 29,4; 29,5; 29,6; 31,9 (Alkylkette), 70,5 (Alkyl-C-O-), 64,2; 71,8; 72,4 (Glycerin-C)

16. Synthese von [1-(4,4'-Dimethoxytrityl)]-3-hexadecylglycerol (Pam3)

Arbeitsvorschrift: Zum Trocknen werden 10 mmol Pam2 (3,16 g) in 15 ml Pyridinabs gelöst und das Lösungsmittel wieder abgezogen. Dieser Vorgang wird wiederholt. Zu einer Lösung des Diols in 100 ml Pyridinabs werden 12 mmol (4,06 g) Dimethoxytrityl-chlorid (in 50 ml Pyridin gelöst) langsam zugetropft und 24 h bei RT gerührt. Danach wird die Reaktion mit 5 ml Methanol abgebrochen und das Reaktionsgemisch zur Trockene eingeengt. Letzte Spuren von Pyridin werden durch azeotropes Schleppen mit Toluol entfernt. Der Rückstand wird in 300 ml DCM aufgenommen, mit gesättigter wässriger KCl-Lösung und H2O gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wird der Rückstand über Kieselgel chromatographiert (n-Hexan/Diethylether/TEA = 40:60:1) (R. A. Jones "Oligonuclotide Synthesis: A Practical Approach" ed. M. J. Gait, IRL Press (1984) 23).
Ausbeute: 4,9 g (79,3% der Theorie)
DC (n-Hexan/Diethylether/TEA = 40:60:1): Rf-Wert = 0,42
MS (FD): m/z 618,2 (M+), 303 (DMT+)
1H-NMR (CDCl3): 0,80 (t), 1,20 (s), 1,96 (s), 2,36 (d), 2,72 (s), 3,27 (d), 3,32–3,48 (m), 3,75 (m), 6,61–6,76 (m), 7,08–7,37 (m)

17. Synthese von [1-(4,4'-Dimethoxytrityl)]-2-succinyl-3-hexadecylglycerol (Pam4)

Arbeitsvorschrift: 1,26 mmol Pam3 (0,78 g) werden zwei Mal mit Pyridin getrocknet. Zu einer Lösung des Alkohols in 5 ml Pyridinabs werden 0,76 mmol DMAP (92 mg) und 1,26 mmol Bernsteinsäureanhydrid (126 mg) zugegeben. Nach 12 h Rühren bei RT wird die Reaktionslösung in 30 ml DCM aufgenommen, zwei Mal mit je 30 ml H2O gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wird der Rückstand über Kieselgel chromatographiert (Ethylacetat/Methanol/NH3 (25% in H2O) = 5:1:1) (D. W. Will, T. Brown Tetrahedron Lett. 33 (1992) 2729.).
Ausbeute: 0,6 g (66,3%)
DC (EtOAc/MeOH/NH3(H2O) = 5:1:1): Rf-Wert = 0,32
MS (FD): m/z 718 (M+), 303 (DMT+), 1020,7 (M + DMT)+

18. Stimulation von humanen Zellen mit einem erfindungsgemäßem Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure

  • a) Zur Bestimmung der immunogenen Wirkung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als Adjuvanzien wurden Lipid-modifizierte Nukleinsäuren, die eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 oder 5 enthalten, mit humanen Zellen koinkubiert. Dazu wurden bspw. humane PBMC-Zellen mit RNA in X-VIVO-15 medium (Fa. BioWhittaker Katalog-Nr. BE04-418Q), angereichert mit 2 mM L-Glutamine (BioWhittaker), 10 U/ml Penicillin (BioWhittaker) und 10 μg/ml Streptomycin 16 h mit 10 μg/ml RNA (mRNA kodierend β-Galactosidase oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure der Formel (I), die Lipid-modifiziert wurde, und optional mit 10 μg/ml Protamin koinkubiert. Die Überstände wurden abgenommen und die IL-6-, IL-12- bzw. TNFα-Ausschüttung mittels ELISA analysiert.
  • b) In einem weiteren Experiment wurde die Freisetzung von TNF-α durch humane PBMC-Zellen nach Stimulation mit erfindungsgemäß verwendeten RNA-Oligonukleotiden (s.o.) sowie erfindungsgemäßen verwendeten Adjuvanzien bestimmt.
    Dazu wurden humane PBMC-Zellen mit 10 μg/ml RNA Oligonukleotiden in X-VIVO 15 medium (BioWhittaker), angereichert mit 2 mM L-Glutamin (BioWhittaker), 10 U/ml Penicillin (BioWhittaker) und 10 μg/ml Streptomycin 16h koinkubiert. Die Überstände wurden abgenommen und mittels ELISA analysiert.

Vorteile der Erfindung:

Das erfindungsgemäße immunstimulierende Adjuvanz in Form einer Nukleinsäure der allgemeinen Formel (I): GlXmGn, optional in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure und/oder in Kombination mit weiteren Adjuvanzien, ermöglicht einerseits eine Stabilisierung und eine bessere Zellgängigkeit von (pharmakologischen) Wirkstoffen sowie eine bessere Verteilung dieser Wirkstoffe innerhalb der Zelle. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, dass durch das erfindungsgemäße immunstimulierende Adjuvanz in Form einer Nukleinsäure der allgemeinen Formel (I): GlXmGn selbst als biologische Wirkung eine Steigerung der Immunreaktion hervorrufen kann. Dies kann einerseits durch eine Unterstützung des eigentlichen Antisense-Mechanismus, z.B. durch bessere Bindung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der allgemeinen Formel (I): GlXmGn aufgrund von Interkalation, geschehen, andererseits ist auch eine unabhängige Wirkung des erfindungsgemäßen immunstimulierenden Adjuvanz in Form einer Nukleinsäure der allgemeinen Formel (I): GlXmGn zur Steigerung der Stimulation denkbar. So wurde erfindungsgemäß z.B. ein 3'-Cholesterol-modifiziertes Phosphodiester-Oligonukleotid als immunstimulierendes Adjuvanz offenbart, das zytotoxisch auf spezielle Tumorzellen wirken kann. Zwar kann das erfindungsgemäße 3'-Cholesterol-modifiziertes Phosphodiester-Oligonukleotid auch sequenzspezifisch agieren, jedoch nicht durch Antisense-Effekte. Auch trägt die bei Cholesterol beschriebene rezeptorvermittelte Endozytose keinen wesentlichen Beitrag zur gefundenen ungewöhnlichen immunstimulierenden Wirkung. Dieser überraschende Effekt beruht daher im wesentlichen auf einer immunstimulierenden Wirkung der eingesetzten erfindungsgemäßen Nukleinsäure der allgemeinen Formel (I): GlXmGn, ggf. Lipid-modifiziert, wobei die Art der optionalen 3'- bzw. 5'-Modifizierung (Lipid-Modifizierung) eine bedeutende Rolle spielt. Zusammenfassend zeigt daher das erfindungsgemäße immunstimulierende Adjuvanz in Form einer Nukleinsäure der allgemeinen Formel (I): GlXmGn eine vorteilhafte immunstimulierende Wirkung und erhöht zugleich die (Zelt-)Permeabilität ggf. zusätzlich enthaltener Wirkstoffe.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.