Title:
Stabilisierung von NAD/NADH
Kind Code:
B4


Abstract:

Testelement zur Bestimmung eines Analyten, umfassend (i) ein Coenzym abhängiges Enzym oder ein Substrat für ein derartiges Enzym und (ii) als Coenzym eine Verbindung mit folgender allgemeiner Formel (I): embedded imagemit
A = Adenin oder ein Analog davon,
T = jeweils unabhängig O, S,
U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V = OH oder eine Phosphatgruppe,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder C1-C2-Alkyl,
X1,X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = (i) eine lineare Gruppe mit 4-6 C-Atomen, vorzugsweise 4 C-Atomen ist, in welche gegebenenfalls 1 oder 2 C-Atome durch ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N ersetzt sind, oder (ii) ein Rest umfassend eine cyclische Verbindung mit 6 C-Atomen, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält, und einen Rest CR42 gebunden an die zyklische Verbindung sowie an X2, mit R4 = jeweils unabhängig H, F, CH3,
mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Bindung verknüpft sind, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon. embedded image




Inventors:
Heindl, Dieter (82396, Pähl, DE)
Hoenes, Joachim (64673, Zwingenberg, DE)
Horn, Carina (68647, Biblis, DE)
Herdewijn, Piet (Rotselaar, BE)
Application Number:
DE102006035020A
Publication Date:
08/23/2018
Filing Date:
07/28/2006
Assignee:
Roche Diabetes Care GmbH, 68305 (DE)
International Classes:



Foreign References:
59121391999-06-15
Other References:
NIEKAMP, C. W.; HINZ, H.-J.; JAENICKE, R.; WOENCKHAUS, C.; JECK, R.: Correlations Between Tertiary Structure and Energetics of Coenzyme Binding in Pig Heart Muscle Lactate Dehydrogenase. In: Biochemistry, Vol. 19, 1980, S. 3144-3152
WOENCKHAUS, C.; VOLZ, M.; PFLEIDERER, G.: Preparation and Properties of Nicotinamide-N1-Beta-Glucopyranosyl Phosphate and Nicotinamide-Glucoside-Adenine Dinucleotide; Zeitschrift für Naturforschung, No. 19b, 1964, S. 467-470
Attorney, Agent or Firm:
Weickmann & Weickmann Patent- und Rechtsanwälte PartmbB, 81679, München, DE
Claims:
Testelement zur Bestimmung eines Analyten, umfassend (i) ein Coenzym abhängiges Enzym oder ein Substrat für ein derartiges Enzym und (ii) als Coenzym eine Verbindung mit folgender allgemeiner Formel (I): embedded imagemit
A = Adenin oder ein Analog davon,
T = jeweils unabhängig O, S,
U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V = OH oder eine Phosphatgruppe,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder C1-C2-Alkyl,
X1,X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = (i) eine lineare Gruppe mit 4-6 C-Atomen, vorzugsweise 4 C-Atomen ist, in welche gegebenenfalls 1 oder 2 C-Atome durch ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N ersetzt sind, oder (ii) ein Rest umfassend eine cyclische Verbindung mit 6 C-Atomen, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält, und einen Rest CR42 gebunden an die zyklische Verbindung sowie an X2, mit R4 = jeweils unabhängig H, F, CH3,
mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Bindung verknüpft sind, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Testelement zur Bestimmung von Glucose, umfassend eine Glucose-Dehydrogenase und als Coenzym eine Verbindung mit der allgemeinen Formel (I) oder ein Salz davon.

Testelement nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substituenten an Z ausgewählt sind aus der Grupppe OH, F, Cl sowie C1-C2-Alkyl, gegebenenfalls fluoriert oder chloriert oder/und OHsubstituiert, O-C1-C2-Alkyl.

Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend als Coenzym eine Verbindung mit folgender allgemeiner Formel (I') embedded imagemit
A = Adenin oder ein Analog davon,
T = jeweils unabhängig O, S,
U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V = OH oder eine Phosphatgruppe,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig
H oder C1-C2-Alkyl,
X1,X2 = jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y = NH, S, O, CH2,
Z = ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Sechsring, insbesondere eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) embedded imagewobei zwischen R1 und R2 bzw. zwischen R1' und R2' jeweils unabhängig einer Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann, wenn zwischen R1 und R2 bzw. R1' und R2' eine Einfachbindung vorliegt,
R1, R1' = jeweils unabhängig O, S, NCH3, NH, CR42, CHOH, CHOCH3, wobei R1 oder R1' = nicht gleichzeitig ein Heteroatom sein können,
R2, R2' = jeweils unabhängig CR42, CHOH, CHOCH3, wenn zwischen R1 und R2 bzw. R1' und R2' eine Doppelbindung vorliegt,
R1, R1', R2, R2' = jeweils unabhängig CR4,
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3,
R6, R6' = jeweils unabhängig CH, CCH3, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit W = CONH2 oder COCH3.

Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Form eines Teststreifens.

Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Dehydrogenase ist, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, ausgewählt aus L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).

Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Nachweis von Glucose, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Glucose-Dehydrogenase ist.

Verbindung der allgemeinen Formel (I"): embedded imagemit
A = Adenin oder ein Analog davon,
T = jeweils unabhängig O, S,
U = jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V = OH oder eine Phosphatgruppe,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder C1-C2-Alkyl,
X1,X2 = jeweils unabhängig O, CH2, NH, NCH3,
Y = jeweils unabhängig NH, S, O, CH2,
(i) Z = eine lineare Gruppe der allgemeinen Formel - (CR42)n - mit
n = 4-6, vorzugsweise 4, und
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3, CH2OH, mit der Maßgabe, dass mindestens ein Rest U BH3- oder BCNH2- ist,
oder
(ii) Z = ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Sechsring, insbesondere eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) embedded imagewobei zwischen R1 und R2 bzw. zwischen R1' und R2' jeweils unabhängig einer Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann, wenn zwischen R1 und R2 bzw. R1' und R2' eine Einfachbindung vorliegt,
R1, R1' = jeweils unabhängig O, S, NCH3, NH, CR42, CHOH, CHOCH3, wobei R1 oder R1' = nicht gleichzeitig ein Heteroatom sein können,
R2, R2' = jeweils unabhängig CR42, CHOH, CHOCH3, wenn zwischen R1 und R2 bzw. R1' und R2' eine Doppelbindung vorliegt,
R1, R1', R2, R2' = jeweils unabhängig CR4,
R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3,
R6, R6' = jeweils unabhängig CH, CCH3, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Verbindung nach Anspruch 9 mit W = CONH2 oder COCH3.

Verbindung nach Anspruch 9 oder 10, mit der Formel (III): embedded imagemit
U = OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V = OH oder eine Phosphatgruppe,
W = COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder C1-C2-Alkyl,
X = O, CH2, NH,
R1 = CR42, O, S, NCH3, NH, CH, CHOH, CHOH3,
R4' = H, OH, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit der Formel (IV) embedded imagemit
X = O, CH2, NH, NCH3 oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit der Formel (V) embedded imagemit
X = O, CH2, NH, NCH3 oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit der Formel (VI) embedded imagemit
X = O, CH2, NH, NCH3 oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Enzym-Coenzym-Komplex, bestehend aus einer Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 14 in Kombination mit einem geeigneten Enzym.

Komplex nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Dehydrogenase ist, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, ausgewählt aus L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).

Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 14 oder eines Komplexes nach Anspruch 15 oder 16 zum Nachweis eines Analyten in einer Probe durch eine enzymatische Reaktion.

Reagenzienkit, beinhaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 9 bis 14 und gegebenenfalls ein geeignetes Enzym oder einen Enzym-Coenzym-Komplex nach Anspruch 15 oder 16 sowie einen geeigneten Reaktionspuffer.

Reagenzienkit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Dehydrogenase ist, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, wie etwa einer L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5).

Verwendung des Testelements nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder des Reagenzienkits nach Anspruch 18 oder 19 zur Bestimmung von Analyten, ausgewählt aus Glucose, Milchsäure, Äpfelsäure, Glycerin, Alkohol, Cholesterin, Triglyceride, Ascorbinsäure, Cystein, Glutathion, Peptide, Harnstoff, Ammonium, Salicylat, Pyruvat, 5'-Nukleotidase, Creatinkinase (CK), Lactat-Dehydrogenase (LDH) und Kohlendioxid.

Verfahren zum Nachweis eines Analyten, umfassend die Schritte
(a) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Testelement nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einem Reagenzienkit nach Anspruch 18 oder 19, umfassend ein Coenzym, und
(b) Nachweisen des Analyten.

Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Analyten photometrisch oder fluorometrisch erfolgt.

Description:

Die Erfindung betrifft stabile Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD/NADH)-bzw. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (NADP/NADPH)-Derivate, Enzym-Komplexe dieser Derivate und ihre Verwendung in biochemischen Nachweisverfahren und Reagenzienkits.

Messsysteme zur biochemischen Analytik sind wichtige Bestandteile klinisch relevanter Analyseverfahren. Hierbei steht die Messung von Analyten, z.B. Metaboliten oder Substraten, im Vordergrund, welche mit Hilfe eines Enzyms direkt oder indirekt bestimmt werden. Die Analyten werden hierbei mit Hilfe eines Enzym-Coenzym-Komplexes umgesetzt und anschließend quantifiziert. Dabei wird der zu bestimmende Analyt mit einem geeigneten Enzym und einem Coenzym in Kontakt gebracht, wobei das Enzym meist in katalytischen Mengen eingesetzt wird. Das Coenzym wird durch die enzymatische Reaktion verändert, z.B. oxidiert bzw. reduziert. Dieser Vorgang kann direkt oder durch einen Mediator elektrochemisch oder photometrisch erfasst werden. Eine Kalibrierung liefert einen direkten Zusammenhang des Messwerts mit der Konzentration des zu bestimmenden Analyten.

Coenzyme sind organische Moleküle, die kovalent oder nicht-kovalent an ein Enzym gebunden sind und durch die Umsetzung des Analyten verändert werden. Prominente Beispiele für Coenzyme sind Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bzw. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotidphosphat (NADP), aus denen durch Reduktion NADH bzw. NADPH entstehen.

Aus dem Stand der Technik bekannte Messsysteme zeichnen sich durch eine zeitlich begrenzte Haltbarkeit sowie durch spezielle Anforderungen an die Umgebung, wie Kühlung oder trockene Lagerung, zur Erzielung dieser Haltbarkeit aus. Bei bestimmten Anwendungsformen, z.B. bei Tests, die vom Endverbraucher selbst durchgeführt werden, wie etwa beim Blutglucose-Selbstmonitoring, können daher Fehlergebnisse durch falsche, unbemerkte Fehllagerung vorkommen. Besonders die Erschöpfung von Trocknungsmitteln durch zu langes Öffnen der Primärverpackungen kann zu Fehlmessungen führen, die bei manchen Systemen vom Verbraucher kaum zu erkennen sind.

Eine bekannte Maßnahme, die zur Erhöhung der Stabilität von biochemischen Messsystemen eingesetzt wird, ist die Verwendung stabiler Enzyme, z.B. die Verwendung von Enzymen aus thermophilen Organismen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, Enzyme durch chemische Modifizierung, z.B. Quervernetzung, oder durch Mutagenese zu stabilisieren. Darüber hinaus können auch Enzymstabilisatoren, wie z.B. Trehalose, Polyvinylpyrrolidon und Serumalbumin, zugesetzt werden oder die Enzyme z.B. durch Photopolymerisation in Polymernetzwerke eingeschlossen werden.

Weiterhin wird versucht, die Haltbarkeit biochemischer Messsysteme durch Verwendung stabiler Mediatoren zu verbessern. So wird durch die Verwendung von Mediatoren mit möglichst niedrigem Redoxpotential die Spezifität von Tests erhöht und Störungen während der Reaktion eliminiert. Eine untere Grenze für das Redoxpotential von Mediatoren bilden jedoch die Redoxpotentiale der Enzym/Coenzymkomplexe. Werden diese unterschritten, wird die Reaktion mit den Mediatoren verlangsamt oder gar unterbunden.

Alternativ können auch biochemische Messsysteme ohne Mediatoren verwendet werden, bei denen beispielsweise eine direkte Detektion von Coenzymen, z.B. des Coenzyms NADH, erfolgt. Ein Nachteil solcher Messsysteme besteht jedoch darin, dass Coenzyme, wie NAD und NADP, instabil sind.

NAD und NADP sind basenlabile Moleküle, deren Abbauwege in der Literatur beschrieben sind (N.J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzyms Academic Press New York, London 1982, Hrsg. J. Everese, B. Anderson, K. You, Kapitel 3, Seiten 56-65). Im Wesentlichen entsteht beim Abbau von NAD bzw. NADP ADP-Ribose, indem die Glycosyl-Bindungen zwischen der Ribose und der Pyridineinheit gespalten wird. Die reduzierten Formen NADH und NADPH sind hingegen säurelabil: z.B. ist die Epimerisierung ein bekannter Abbauweg. In beiden Fällen liegt der Instabilität von NAD/NADP und NADH/NADPH die Labilität der Glykosyl-Bindung zwischen der Ribose- und der Pyridineinheit zugrunde. Aber auch unter nicht drastischen Bedingungen, wie z.B. in wässriger Lösung, geschieht die Hydrolyse der Coenzyme NAD bzw. NADP allein schon durch die Umgebungsfeuchte. Diese Instabilität kann zu Ungenauigkeiten bei der Messung von Analyten führen.

Eine Reihe von NAD/NADP-Derivaten wird z.B. in B.M. Anderson in the Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982 , Hrsg. J. Everese, B. Anderson, K. You, Kapitel 4 beschrieben. Die meisten dieser Derivate werden allerdings nicht gut von Enzymen akzeptiert. Das einzige Derivat, das daher bisher für diagnostische Tests verwendet wurde, ist 3-Acetylpyridin-Adenin-Dinukleotid (Acetyl NAD), welches erstmals 1956 beschrieben wurde (N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956), 221, 823). Auch dieses Coenzym zeigt eine geringe Akzeptanz von Enzymen und eine Änderung im Redoxpotential.

In WO 01/94370 ist die Verwendung weiterer NAD-Derivate mit einer modifizierten Pyridin-Gruppe beschrieben. Modifikationen der Nicotinamid-Gruppe haben jedoch generell direkten Einfluss auf die katalytische Reaktion. In den meisten Fällen ist dieser Einfluss negativ.

In einem weiteren Stabilisierungskonzept wurde die Ribose-Einheit verändert, um dadurch die Stabilität der Glycosyl-Bindung zu beeinflussen. Dieses Vorgehen interferiert nicht direkt mit der katalytischen Reaktion der Nicotinamid-Gruppe. Es kann jedoch ein indirekter Einfluss bestehen, sobald das Enzym eine starke und spezifische Bindung an die Ribose-Einheit aufweist. Kaufmann et al. offenbaren diesbezüglich in WO 98/33936 und US 5,801,006 bzw. in WO 01/49247 eine Reihe von Thioribose-NAD Derivaten. Ein Zusammenhang zwischen der Modifizierung der Nicotinamid-Riboseeinheit und der Aktivität der Derivate in enzymatischen Reaktionen wurde bisher jedoch nicht gezeigt.

CarbaNAD, ein Derivat ohne Glycosyl-Bindung, wurde erstmals 1988 beschrieben (J.T. Slama, Biochemistry 1989, 27, 183 und Biochemistry 1989, 28, 7688). Die Ribose wird hierin durch eine carbazyklische Zucker-Einheit substituiert. CarbaNAD wurde zwar als Substrat für Dehydrogenasen beschrieben, seine Aktivität wurde bisher jedoch nicht in biochemischen Nachweisverfahren in der Klinik nachgewiesen.

Ein ähnlicher Ansatz wurde später von G.M. Blackburn, Chem. Comm., 1996, 2765 beschrieben, um CarbaNAD mit einer Methylenbisphosphonat-Verbindung an Stelle des natürlichen Pyrophosphats herzustellen. Das Methylenbisphosphonat zeigt erhöhte Stabilität gegen Phosphatasen und wurde als Inhibitor für ADP-Ribosylcyclase verwendet. Eine Stabilitätserhöhung gegenüber Hydrolyse war nicht das Ziel (J.T. Slama, G.M. Blackburn).

Die zugrunde liegende Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, stabile bioanalytische Messsysteme, insbesondere zur Bestimmung von Glucose, bereitzustellen, die die Hydrolyseempfindlichkeit von NAD/NADP vermeiden und gleichzeitig als Coenzyme in Enzymreaktionen aktiv sind.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Testelement zur Bestimmung eines Analyten, umfassend (i) ein Coenzym abhängiges Enzym oder ein Substrat für ein derartiges Enzym und (ii) als Coenzym eine Verbindung mit folgender allgemeiner Formel (I): embedded imagemit

A =
Adenin oder ein Analog davon,
T =
jeweils unabhängig O, S,
U =
jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V =
OH oder eine Phosphatgruppe,
W =
COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder C1-C2-Alkyl,
X1,X2 =
jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y=
NH, S, O, CH2,
Z =
(i) eine lineare Gruppe mit 4-6 C-Atomen, vorzugsweise 4 C-Atomen ist, in welche gegebenenfalls 1 oder 2 C-Atome durch ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N ersetzt sind, oder
(ii) ein Rest umfassend eine cyclische Verbindung mit 6 C-Atomen, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält und einen Rest CR42 gebunden an die zyklische Verbindung sowie an X2, mit
R4 = jeweils unabhängig H, F, CH3,
mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Bindung verknüpft sind, oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist W = CONH2 oder COCH3.

Bevorzugte Substituenten an Z sind ausgewählt aus der Gruppe OH, F, Cl sowie C1-C2-Alkyl, gegebenenfalls fluoriert oder chloriert oder/und OHsubstituiert, O-C1-C2-Alkyl.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird Z durch -CR42-Cyc- dargestellt, wobei -Cyc- ein Rest umfassend eine cyclische Verbindung mit 6 C- Atomen, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome ausgewählt aus O, S und N sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Substituenten enthält, ist und CR42 wie oben definiert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Testelement zur Bestimmung von Glucose umfassend eine Glucose-Dehydrogenase und eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie oben angegeben oder ein Salz davon.

Überraschenderweise sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Hydrolyse-stabil und gute Substrate in enzymatischen Nachweisverfahren und können zur biochemischen Diagnostik eingesetzt werden. Dieser Befund steht im Gegensatz zu dem der meisten der bisher bekannten NAD/NADP-Derivate, da diese Derivate in enzymatischen Nachweisverfahren in der Regel nur sehr kurz stabil sind.

Die Vorteile der erfindungsgemässen Verbindungen gegenüber dem Stand der Technik sind:

  • - hohe Stabilität,
  • - hohe enzymatische Aktivität,
  • - einfache und kostengünstige Synthese,
  • - Anwendbarkeit in allen bisher bekannten biochemischen Nachweisverfahren.

Durch die Bereitstellung stabiler NAD/NADP-Derivate mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt in Kombination mit einer stabilisierenden Rezeptur, wie z.B. durch den Einschluss von Enzymen in Polymernetzwerke, können die Nachteile der bisher bekannten biochemischen Nachweisverfahren weitgehend vermieden werden. Weiterhin müssen keine stabilisierenden Zusätze eingesetzt werden. Dieses ist insbesondere vorteilhaft, da, je geringer die Anzahl der beteiligten, reaktiven Substanzen ist, die Chance höher ist, eine stabile Rezeptur für die Analyten-Bestimmung zu erhalten.

Mit der vorliegenden Erfindung werden Testelemente, umfassend eine Reihe stabiler NAD/NADP-Derivate, die für den Einsatz als Coenzym auf dem Testelement eine ausreichende enzymatische Aktivität besitzen, zur Verfügung gestellt.

Stabile NAD/NADP-Derivate können in allgemein bekannten Syntheseverfahren hergestellt werden. Hierzu wird von einem cyclischen Aminoalkohol die Aminogruppe via Zincke Chemie in das Pyridiniumderrivat überführt. Die primäre OH-Gruppe wird anschließend phosphoryliert und mit einem aktivierten AMP-Derivat zum NAD-Derivat gekoppelt. Alternativ kann auch die primäre OH-Gruppe zuerst phosphoryliert werden und dann die Aminogruppe mittels Zinckereaktion in einem Pyridin überführt werden.

Eine weitere Syntheseroute ist die Aktivierung des primären Alkohols zum Tosylat oder Jodid und die anschließende Alkylierung von ADP.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Testelements umfassen z.B. Verbindungen mit folgender allgemeiner Formel (I'): embedded imagemit

A =
Adenin oder ein Analog davon,
T =
jeweils unabhängig O, S,
U =
jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V =
OH oder eine Phosphatgruppe,
W =
COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder C1-C2-Alkyl,
X1, X2 =
jeweils unabhängig O, CH2, CHCH3, C(CH3)2, NH, NCH3,
Y =
NH, S, O, CH2,
Z =
ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Sechsring, insbesondere eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) embedded image
wobei zwischen R1 und R2 bzw. zwischen R1' und R2' jeweils unabhängig eine Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann, wenn zwischen R1 und R2 bzw. R1' und R2' eine Einfachbindung vorliegt,
  • R1, R1' = jeweils unabhängig O, S, NCH3, NH, CR42, CHOH, CHOCH3, wobei R1 oder R1' = nicht gleichzeitig ein Heteroatom sein können,
  • R2, R2' = jeweils unabhängig CR42, CHOH, CHOCH3,
    wenn zwischen R1 und R2 bzw. R1' und R2' eine Doppelbindung vorliegt,
  • R1, R1', R2, R2' = jeweils unabhängig CR4,
  • R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3,
  • R6, R6' = jeweils unabhängig CH, CCH3,
oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen mit folgender allgemeiner Formel (I"): embedded imagemit

A =
Adenin oder ein Analog davon,
T =
jeweils unabhängig O, S,
U =
jeweils unabhängig OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V =
OH oder eine Phosphatgruppe,
W =
COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder C1-C2-Alkyl,
X1, X2 =
jeweils unabhängig O, CH2, NH, NCH3,
Y =
jeweils unabhängig NH, S, O, CH2,
Z =
ein gesättiger oder ungesättigter carbocyclischer oder heterocyclischer Sechsring, insbesondere eine Verbindung der allgemeinen Formel (II) embedded image
wobei zwischen R1 und R2 bzw. zwischen R1' und R2' jeweils unabhängig einer Einfach- oder Doppelbindung vorliegen kann, wenn zwischen R1 und R2 bzw. R1' und R2' eine Einfachbindung vorliegt,
  • R1, R1' = jeweils unabhängig O, S, NCH3, NH, CR42, CHOH, CHOCH3, wobei R1 oder R1' = nicht gleichzeitig ein Heteroatom sein können,
  • R2, R2' = jeweils unabhängig CR42, CHOH, CHOCH3, wenn zwischen R1 und R2 bzw. R1' und R2' eine Doppelbindung vorliegt,
  • R1, R1', R2, R2' = jeweils unabhängig CR4,
  • R4 = jeweils unabhängig H, F, Cl, CH3,
  • R6, R6' = jeweils unabhängig CH, CCH3,
mit der Maßgabe, dass Z und der Pyridin-Rest nicht durch eine glycosidische Bindung verknüpft sind,
oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen Adenin-Analoga, wie z.B. C8- und N6-substituiertes Adenin, Deaza-Varianten wie 7-Deaza, Azavarianten wie 8-Aza oder Kombinationen wie 7-Deaza oder 8-Aza oder carbocyclische Analoga, wie Formycin, wobei die 7-Deazavarianten in der 7-Position mit Halogen, C1-C6-Alkinyl, -Alkenyl oder -Alkyl substituiert sein können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Verbindungen Adenosin-Analoga, welche statt Ribose z.B. 2-Methoxy-deoxyribose, 2'-Fluoro-deoxyribose, Hexitol, Altritol bzw. polycyclische Analoga wie Bicyclo-, LNA- und Tricyclo-Zucker enthalten.

Insbesondere können auch (Di-)-Phosphatsauerstoffe isoelektronisch ersetzt sein, wie z.B. O- durch S- bzw. BH3-, O durch NH, NCH3 bzw. CH2 und =O durch =S.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist eine Verbindung sowie ein Testelement umfassend dieselbe mit der allgemeinen Formel (III): embedded imagemit

U =
OH, SH, BH3-, BCNH2-,
V =
OH oder eine Phosphatgruppe,
W =
COOR, CON(R)2, COR, CSN(R)2 mit R = jeweils unabhängig H oder C1-C2-Alkyl,
X =
O, CH2, NH,
R1 =
CR42, O, S, NCH3, NH, CH, CHOH,
R4' =
H, OH,
oder ein Salz oder gegebenenfalls eine reduzierte Form davon.

Biochemische Nachweise von Analyten, beispielsweise Parametern in Körperflüssigkeiten, wie etwa Blut, Serum, Plasma oder Urin, bzw. in Abwasserproben oder Lebensmitteln spielen eine große Rolle in der Diagnostik. Dabei wird der zu bestimmende Analyt mit einem geeigneten Enzym und einem Coenzym in Kontakt gebracht.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Enzym-Coenzym-Komplex bestehend aus einer erfindungsgemässen Verbindung in Kombination mit einem geeigneten Enzym.

Als Analyten können beliebige biologische oder chemische Substanzen bestimmt werden, die durch eine Redoxreaktion nachgewiesen werden können, z.B. Substanzen, bei denen es sich um Substrate eines Coenzymabhängigen Enzyms handelt oder Coenzym-abhängige Enzyme selbst. Bevorzugte Beispiele für Analyten sind Glucose, Milchsäure, Äpfelsäure, Glycerin, Alkohol, Cholesterin, Triglyceride, Ascorbinsäure, Cystein, Glutathion, Peptide, Harnstoff, Ammonium, Salicylat, Pyruvat, 5'-Nukleotidase, Creatinkinase (CK), Lactat-Dehydrogenase (LDH), Kohlendioxid etc.

Beim Nachweis von Enzymsubstraten enthält das Testelement vorzugsweise neben dem Coenzym ein zum Nachweis des Substrats geeignetes Enzym. Geeignete Enzyme sind z.B. Dehydrogenasen, ausgewählt aus einer Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47), Lactat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.27, 1.1.1.28), Malat-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.37), Glycerin-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.6), Alkohol-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase oder Aminosäure-Dehydrogenase, z. B. L-Aminosäure-Dehydrogenase (E.C.1.4.1.5). Weitere geeignete Enzyme sind Oxidasen, wie etwa Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4) oder Cholesterinoxidase (E.C.1.1.3.6) bzw. Aminotransferasen, wie z.B. Aspartat oder Alanin Aminotransferase, 5'-Nukleotidase oder Kreatin-Kinase.

Beim Nachweis von Enzymen enthält das Testelement vorzugsweise neben dem Coenzym ein zum Nachweis des Enzyms geeignetes Enzym-Substrat.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines erfindungsgemäßen Enzym-Coenzym-Komplexes zum Nachweis eines Analyten in einer Probe durch eine enzymatische Reaktion. Besonders bevorzugt ist hierbei der Nachweis von Glucose mit Hilfe von Glucose-Dehydrogenase.

Die Veränderung des Coenzyms, d.h. der erfindungsgemäßen Verbindung, durch Reaktion mit dem Analyten (wenn der Analyt ein Enzymsubstrat ist) bzw. durch eine Analyt-katalysierte Reaktion (wenn der Analyt ein Enzym ist) kann grundsätzlich auf beliebige Art und Weise nachgewiesen werden. Hier können grundsätzlich alle aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zum Nachweis enzymatischer Reaktionen eingesetzt werden. Vorzugsweise wird jedoch die Veränderung des Coenzyms durch optische Methoden nachgewiesen. Optische Nachweismethoden umfassen beispielsweise die Messung von Absorption, Fluoreszenz, Circulardichroismus (CD), optische Rotationsdispersion (ORD), Refraktometrie etc. Besonders bevorzugt wird die Veränderung des Coenzyms durch Messung der Fluoreszenz nachgewiesen. Die Fluoreszenzmessung ist hochsensitiv und ermöglicht den Nachweis selbst geringer Konzentrationen des Analyten in miniaturisierten Systemen.

Zum Nachweis eines Analyten kann ein Flüssigtest verwendet werden, wobei das Reagenz z.B. in Form einer Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nichtwässrigen Flüssigkeit oder als Pulver oder Lyophilisat vorliegt. Es kann jedoch auch ein Trockentest verwendet werden, wobei das Reagenz auf einem Träger aufgebracht ist. Der Träger kann beispielsweise einen Teststreifen, umfassend ein saugfähiges oder/und quellbares Material, umfassen, das von der zu untersuchenden Probeflüssigkeit benetzt wird.

Als Nachweisreagenz kann aber auch eine Gelmatrix mit einem darin eingelagerten Enzym-Coenzym-Komplex verwendet werden (siehe DE 102 218 45 A1).

Das Enzym kann hierbei entweder zusammen mit der erfindungsgemäßen Verbindung in die Matrix einpolymerisiert werden oder die Matrix kann nach der Polymerisation in Gegenwart des Enzyms mit einer Lösung des Coenzyms in Kontakt gebracht werden, so dass sich der entsprechende Enzym-Coenzym-Komplex bildet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst einen Reagenzienkit sowie dessen Verwendung zum Nachweis von Analyten. Der Reagenzienkit kann eine erfindungsgemäße Verbindung, ein geeignetes Enzym sowie einen geigneten Reaktionspuffer enthalten. Geeignete Enzyme wurden bereits beschrieben. Der erfindungsgemäße Reagenzienkit ist vielseitig anwendbar und kann zur Bestimmung von Analyten, wie z. B. Glucose, Milchsäure, Äpfelsäure, Glycerin, Alkohol, Cholesterin, Triglyceride, Ascorbinsäure, Cystein, Glutathion, Peptide, Harnstoff, Ammonium, Salicylat, Pyruvat, 5'-Nukleotidase, CK, LDH, Kohlendioxid etc., verwendet werden. Bevorzugt ist ein Reagenzienkit, welcher eine erfindungsgemäße Verbindung und Glucose-Dehydrogenase (E.C.1.1.1.47) enthält, zum Nachweis von Glucose im Blut.

Der erfindungsgemäße Reagenzienkit kann zum Nachweis eines Analyten in einem Trocken- oder Flüssigtest verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst einen Teststreifen zum fluorometrischen oder photometrischen Nachweis eines Analyten. Ein solcher Teststreifen enthält eine Verbindung wie zuvor angegeben als Coenzym und gegebenenfalls ein geeignetes Enzym oder ein Enzymsubstrat immobilisiert auf einem saugfähigen oder/und quellbaren Material. Geeignete Materialien können z.B. aus Cellulose, Kunststoffen etc. ausgewählt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, umfassend die Schritte:

  1. (a) Inkontaktbringen einer Probe mit einem erfindungsgemäßen Testelement oder Reagenzienkit, umfassend ein Coenzym und
  2. (b) Nachweisen des Analyten, z.B. anhand der Veränderung des Coenzyms.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Fluoreszenzemission der Coenzyme eine bathochrome Verschiebung zeigt, so dass eine geringe Interferenz mit der Fluoreszenzemission anderer Materialien des Testelements oder/und der Probe besteht.

Alle dargestellten bevorzugten Ausführungsformen eines Gegenstands der vorliegenden Erfindung sollen für die weiteren Gegenstände der Erfindung gelten, wie z.B. bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die Erfindung soll durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele näher erläutert werden.

Figurenliste

  • 1
    Schema zur Herstellung von Hexitolnicotinamid-Adenindinukleotid
  • 2
    Schema zur Herstellung von Altritolnicotinamid-Adenindinukleotid Lithiumsalz
  • 3
    Schema zur Herstellung von Cyclohexennicotinamid-Adenindinukleotid

Beispiele

Die Herstellung stabiler NAD/NADH-Derivate wird exemplarisch an den Synthese-Schemen 1, 2 und 3 dargestellt (1, 2 und 3).

Alle Lösungsmittel wurden vor Gebrauch destilliert und nach Standardverfahren absolutiert. 1H NMR wurde auf einem 200 MHz oder 500 MHz Varian Gerät mit TMS als internen Standard für 1H NMR und DMSOd6 (39,6 ppm) für 13C NMR gemessen. 31P NMR Spektren wurden mit 85 % H3PO4 als externen Standard gemessen. Massenspektroskopie: Q-Tof-2, Micromaß mit ESI Interface.

DC: Beschichtete Aluminium-Streifen (Fluka Silica Gel/TLC cards, 254 nm) Detektion UV und Anisaldehyd-Schwefelsäure-Spray Säulenchromatographie: Silicagel (0,060-0,200 nm).

1,5-Anhydro-4,6-O-benzyliden-3-deoxy-2-O-methansulfonyl-D-ribohexitol (2)

Unter Eiskühlung und Rühren werden zu einer Lösung von 1,5-Anhydro-4,6-O-benzyliden-3-deoxy-D-glucitol (Andersen M.W. et al., Tetrahedron Lett., 1996, 37, 8147-8150) (1, 5,000 g, 21,16 mmol) und einer Spatelspitze von 4-Dimethylaminopyridin in 40 ml abs. Pyridin-methansulfonylchlorid (3 ml, 38 mmol) gegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 14 h gerührt. Nach Evaporation mittels Rotationsverdampfer wird in Toluol gerührt und erneut evaporiert. Der Rückstand wird dreimal mit warmem CHCl3 diggeriert. Die vereinigten Extrakte werden über eine kurze Silica-Gel-Säule filtriert. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird mit Ether gewaschen und aus Methanol präzipitiert. Ausbeute: (5,103 g, 77%). Rf 0,8 (Hexan/EtOAc 1/2), 0,5 (Hexane/EtOAc 2/1). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 1,92 (ddd, 2J3ax,3eq = 12 Hz, 3J3ax,4 = 11 Hz, 3J2,3ax= 11,5 Hz, 1H, H-3ax), 2,68 (dm, 2J3ax,3eq= 12 Hz, 3J2,3eq = 5,5 Hz, 3J3eq,4= 4 Hz, 1H, H-3eq), 3,06 (s, 3H, CH3), 3,32 (ddd, 3J5,6ax = 10 Hz, 3J4,5 = 8 Hz, 3J5,6eq = 5 Hz, 1H, H-5), 3,41 (t, 2J1ax,1eq = 3J1ax,2 = 11 Hz, H-1ax), 3,59 (ddd, 3J3ax,4 = 11 Hz, 3J4,5 = 8 Hz, 3J3eq,4 = 4 Hz, 1H, H-4) 3,68 (t, 2J6ax,6eq = 3J5,6ax = 10 Hz, 1H, H-6ax), 4,21 (ddd, 2J1ax,1eq = 11 Hz, 3J1eq,2 = 5,5 Hz, 4J1eq,3eq = 2 Hz, 1H, H-1eq), 4,33 (dd, 2J6ax,6eq = 10 Hz, 3J5,6eq = 5 Hz, 1H, H-6eq), 4,81 (m, 3J2,3ax = 11,5 Hz, 3J1ax,2 = 11 Hz, 3J1eq,2 = 3J2,3eq = 5,5 Hz, 1H, H-2), 5,53 (s, 1H, PhCH), 7,33-7,51 ppm (m, 5H, aromatisches H).

1,5-Anhydro-2-azido-4,6-O-benzyliden-2,3-dideoxy-D-arabino-hexitol (3)

Zu einer Lösung von 2 (5,000 g, 15,91 mmol) in 120 ml N,N-Dimethylformamid wird Natriumazid (2,1 g, 32 mmol) gegeben. Die Mischung wird unter Stickstoff und Rühren 31 h auf 80 °C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird dreimal mit warmen CHCl3 diggeriert. Die vereinigten Extrakte werden über eine kurze Silica-Gel-Säule filtriert. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird mit Ether gewaschen und aus Hexan präzipitiert.

Ausbeute 3 (4,073 g, 98 %) farbloses Pulver. Rf 0,9 (Hexan/EtOAc 2/1). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 1,91 (ddd, 2J3ax,3eq = 13 Hz, 3J3ax,4 = 12 Hz, 3J2,3ax = 4 Hz, 1H, H-3ax), 2,33 (dm, 2J3ax,3eq = 13 Hz, 1H, H-3eq), 3,39 (ddd, 3J5,6ax = 10 Hz, 3J5,6eq = 5 Hz, 1H, H-5), 3,69 (dd, 2J1ax,1eq = 12 Hz, 3J1ax,2 = 2 Hz, 1H, H-1ax), 3,77 (t, 2J6ax,6eq= 3J5,6ax = 10 Hz, 1H, H-6ax), 3,55-4,06 (m, 3H, H-1eq, H-2, H-4), 4,28 (dd, 2J6ax,6ex = 10 Hz, 3J5,6eq = 5 Hz, 1H, H-6eq), 5,60 (s, 1H, PhCH), 7,34-7,52 ppm (m, 5H, aromatisches H).

1,5-Anhydro-2-azido-2,3-dideoxy-D-arabino-hexitol (4)

Eine Lösung von 3 (4,000 g, 15,31 mmol) in 180 ml 80 % Eisessig wird 1 h bei 95 °C gerührt. Nach Evaporation mittels Rotationsverdampfer wird in Wasser gerührt und erneut evaporiert. Dann wird mit Toluol gerührt und erneut evaporiert. Der Rückstand wird säulenchromatogrphisch gereinigt (0-10 % EtOAc in Hexan). Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird im Vakuum über P2O5 getrocknet.

Ausbeute 4 (2,174 g, 82 %) Öl. Rf 0,25 (Hexan/EtOAc 1/2). 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 1,72 (ddd, 2J3ax,3eq = 14 Hz, 3J3ax,4 = 11 Hz, 3J2,3ax = 4 Hz, 1H, H-3ax), 2,33 (dm, 2J3ax,3ex = 14 Hz, 1H, H-3eq), 2,67 (br.s, 1H, OH), 3,05 (br.s, 1H, OH), 3,20 (dm, 3J4,5 = 9 Hz, 1H, H-5), 3,59 (dd, 2J1ax,1eq = 12 Hz, 3J1ax,2= 2 Hz, 1H, H-1ax). 3,74-4,04 (m, 5H, H-1eq, H-2, H-4, H-6a, H-6b).

1,5-Anhydro-2-azido-2,3-dideoxy-6-O-phosphono-D-arabino-hexitol Ammoniumsalz (5)

Das Azid 4 (1,004 g, 5,80 mmol) wird unter Stickstoff und durch Rühren in 6 ml Trimethylphosphat (frisch über BaO vakuumdestilliert) gelöst. Bei 0° C werden 1,7 ml einer 1/1 (v/v) Mischung aus Phosphorylchlorid (frisch destilliert) und Trimethylphosphat auf einmal zugegeben. Nach 3 h Rührens bei 0 °C werden 6 ml Eiswasser und 9 ml kaltes Triethylamine. Die Mischung wird am Rotationsverdamper im Vakuum bis zur Trocknung evaporiert. Der Rückstand wird mit Diisopropylether gewaschen und säulenchromatographisch gereinigt [0-35 % Ammoniumhydroxid (20 % Lösung in Wasser) in i-PrOH]. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 5 (0,677 g, 43 %) schwach gelbes Öl. Rf 0,35 (i-PrOH/25 %-NH4OHaq/H2O 6/3/1). 1H NMR (200 MHz, D2O) δ 1,80 (ddd, 2J3ax,3eq = 13,5 Hz, 3J3ax,4 = 11 Hz, 3J2,3ax = 3,5 Hz, 1H, H-3ax), 2,34 (dm, 2J3ax,3eq = 13,5 Hz, 1H, H-3eq), 3,43 (ddd, 3J4,5 = 8,5 Hz, 3J5,6a = 5,5 Hz, 3J5,6b = 2 Hz, 1H, H-5), 3,68 (dd, 2J1ax,1eq = 12,5 Hz, 3J1ax,2 = 1,5 Hz, 1H, H-1ax), 3,77-4,24 ppm (m, 5H, H-1eq, H-2, H-4, H-6a, H-6b).

2-Amino-1,5-anhydro-2,3-dideoxy-6-O-phosphono-D-arabino-hexitol Natriumsalz (6)

Zu einer Lösung des Azids 5 (0,677 g, 2,51 mmol) in 75 ml Wasser gelöst werden 25 ml Methanol und Adamskatalysator (PtO2·H2O, 0,068 g, 0,28 mmol) gegeben. Dei Mischung wird 2 h in einer Parr-Hydrogenierungs-Apparatur (30 psi) geschüttelt. Der Katalysator wird abfiltriert und vom Filtrat das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und auf eine Dowex 50WX4-400 (Na+) Ionenaustauscher-Säule aufgetragen und mit Wasser eluiert. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird im Vakuum über P2O5 getrocknet.

Ausbeute 6 (0,666 g, 98 %) schwach gelbes erstarrtes Öl. Rf 0,2 (i-PrOH/25 %-NH4OHaq/H2O 6/3/1). 1H NMR (500 MHz, D2O) δ 1,93 (ddd, 2J3ax,3eq = 14,4 Hz, 3J3ax,4 = 12,1 Hz, 3J2,3ax = 4,1 Hz, 1H, H-3ax), 2,34 (m; 2J3ax,3eq = 14,4 Hz, 3J2,3eq = 2,6 Hz, 3J3eq,4 = 5,1 Hz, 4J1eq,3eq = 2,6 Hz, 1H, H-3eq), 3,41 (m, 3J4,5 = 9,6 Hz, 3J5,6a = 4,1 Hz, 3J5,6b = 2,2 Hz, 4J5,P = 0,5 Hz, 1H, H-5), 3,73 (m, 3J2,3ax = 4,1 Hz, 3J2,3eq = 2,6 Hz, 3J1ax,2 = 2,0, 3J1eq,2 = 1,7 Hz, 1H, H-2), 3,78 (dd, 2J1ax,1eq = 13,2 Hz, 3J1ax,2 = 2,0 Hz, 1H, H-1ax), 3,97 (ddd, 2J1ax,1eq = 13,2 Hz, 3J1eq,2 = 1,7 Hz, 4J1eq,3eq = 2,6 Hz, 1H, H-1eq), 3,98 (ddd, 3J3ax,4 = 12,1 Hz, 3J4,5 = 9,6 Hz, 3J3eq,4 = 5,1 Hz, 1H, H-4), 4,01 (ddd, 2J6a,6b = 11,8 Hz, 3J5,6b = 2,2 Hz, 3J6b,P = 5,4 Hz, 1H, H-6b), 4,05 (ddd, 2J6a,6b = 11,8 Hz, 3J5,6a = 4,1 Hz ppm, 3J6a,P = 6,9, H-6a).
31P NMR (202 MHz, D2O) δ 3.51 ppm.

1-(2,4-Dinitrophenyl)-3-carbamoylpyridinium-tetrafluoroborat

Unter Stickstoff werden 58,6 g Dinitrochlorbenzol geschmolzen und dann zu der Schmelze 29,32 g Nicotinamid gegeben. Es wird für 2,5 h bei 110 °C erhitzt. Durch einen Rückflusskühler werden 500 ml eines 3:2(v/v) Ethanol/Wasser-Gemisches zugegeben und unter Rückfluss zum Sieden erhitzt bis eine Lösung entsteht. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur werden 150 ml 50 % Ethanol/ Wasser und 100 ml Wasser zugegeben, in einen Scheidetrichter überführt und dreimal mit je 500 ml Chloroform gewaschen. Die abgetrennte wässrige Phase wird mit 300 ml und 50 g Aktivkohle versetzt, für 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann über einen Seitz Tiefenfilter K 700 filtriert. Das Filtrat wird am Rotationsvedampfer im Vakuum auf ca 100 ml konzentriert, wobei die Badtemperatur nicht über 20 °C steigen darf. Es wird mit 300 ml Wasser verdünnt und unter Rühren bei Raumtemperatur werden 70 g Natriumtetrafluoroborat zugegeben. Das Präzipitat wird aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Das Kristallisat wird abfiltriert mit wenig Aceton und dann mit Diethylether gewaschen und im Hochvakuum bei 40 °C 24 h getrocknet.

Ausbeute 21,1 g (23%). DC (Merck Silica Gel 60 F-254: Butanol/Eisessig/Wasser 5:2:3, Rf =0,56.

1,5-Anhydro-2-(3-carbamoylpyridinium)-2,3-dideoxy-6-O-phosphono-D-glucitol (7)

Unter Rühren wird zu einer Lösung von 6 (0,100 g, 0,40 mmol) in 6 ml Wasser und 4 ml Methanol eine Lösung von 1-(2,4-Dinitrophenyl)-3-carbamoylpyridiniumtetrafluoroborat (0,148 g, 0,46 mmol) in 1,5 ml H2O während 5 h zugetropft. Es wird 4 Tage bei 40 °C gerührt. Während dieser Zeit werden 0,3 ml einer 0,5 M wäßrigen Triethylammoniumbicarbonat (TEAB)-Lösung zugegeben. Der Reaktionsverlauf wird mit DC verfolgt. Sobald kein Ausgangsamin mehr zusehen ist, wird TEAB zugegeben und auf 0 °C abgekühlt. Durch Zentrifugation wird das Präzipitat abgetrennt. Vom Überstand wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer abdestillert. Zur Vorreinigung wird eine Säulenchromatographie an DEAE Whatman DE-52 cellulose (21 mm × 14 cm) mit 0,01 M TEAB als Eluent durchgeführt. Hauptreinigung erfolgt durch HPLC an DEAE Sephadex A-25 cellulose (18 mm × 24 cm), äquilibriert mit 0,01 M TEAB, eluiert wird mit TEAB-Lösung mit zunehmender Konzentration (0,01→0,5M). Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Diese Prozedur wird dreimal wiederholt.

Ausbeute Nukleotide 7 (0,083 g, 59 %) gelbes erstarrtes Öl. Rf 0,15 (i-PrOH/25 %-NH4OHaq/H2O 6/4/1). +ESI MS: m/z 333,1 [M+]; -ESI MS: 331,4 [M+ -2H]-.1H NMR (200 MHz, D2O) δ 2,40 (ddd, 2J3'ax,3'eq = 15 Hz, 3J3'ax,4' = 12 Hz, 3J2',3'ax = 5 Hz, 1H, H-3'ax), 2,66 (dm, 2J3'ax,3'eq = 15 Hz, 3J3'eq,4' = 5 Hz, 1H, H-3'eq), 3,66 (dm, 3J4',5' = 9 Hz, 1H, H-5'), 3,95 (ddd, 3J3'ax,4' = 12 Hz, 3J4',5' = 9 Hz, 3J3'eq,4' = 5 Hz, 1H, H-4'), 4,16 (m, 2H, H-6'), 4,26 (dd, 2J1'ax,1'eq = 14 Hz, 3J1'ax,2' = 3 Hz, 1H, H-1'ax), 4,63 (br.d, 2J1'ax,1'eq = 14 Hz, 1H, H-1'eq), 5,26 (br, 1H, H-2'), 8,27 (dd, 3J4,5 = 8 Hz, 3J5,6 = 6 Hz, 1H, H-5), 8,94 (d, 3J4,5 = 8 Hz, 1H, H-4), 9,39 (d, 3J5,6 = 6 Hz, 1H, H-6), 9,49 ppm (s, 1H, H-2).

Adenosin-5'-(phosphor-di-n-butylphosphinothio-anhydrid)

wurde entsprechend Literatur synthetisiert (Slama, J.T., Radziejewski, C., Oruganti, S., Kaiser, E.T., J. Am. Chem. Soc. (1984), 106, 6778-6785): Rf 0,9 (i-PrOH/25 %-NH4OHaq/H2O 6/3/1): 1H NMR (500 MHz, D2O) δ 0,78 (m, 6H, CH3), 1,27 (m, 4H, CH2(Bu)), 1,46 (m, 4H, CH2(Bu)), 2,04 (m, 4H, CH2(Bu)), 4,17 (dm, 1H), 4,37 (ddd, 1H), 4,54 (dd, J = 5m1 Hz, J = 3,7 Hz, 1H), 4,83 (dd, 1H), 6,12 (d, J = 5,9 Hz, 1H, H-1'), 8,24 (s, 1H, H-2), 8,46 ppm (s, 1H, H-8). 13C NMR (125 MHz, D2O) δ 12,91 (CH3), 12,94 (CH3), 23,0 (MeCH2), 24,2 (EtCH2), 33,76 (d, 1JCP = 68,4 Hz, CP), 33,83 (d, 1JCP = 68,4 Hz, CP), 65,68 (d, 2JCP = 5,8 Hz, C-5'), 70,68 (C-3'), 74,13 (C-2'), 83,91 (d, 3JCP = 9,8 Hz, C-4'), 87,15 (C-1'), 118,84 (C-5), 140,06 (C-8), 149,41 (C-4), 155,86 (C-2), 160,44 ppm (C-6).

31P NMR (202 MHz, D2O) δ -9,17 (d, 2JPP = 34,2 Hz, P=O), 103,9 (d, 2JPP = 34,2 Hz, P=S).

Di-n-butylphosphinothioyl-bromid und Tetra-n-butyldiphosphin-disulfid wurden entsprechend Literatur synthetisiert (Furusawa, K., Sekine, M., Hata, T., J. Chem. Soc., Perkin Trans. I (1976), 1711-1716; Kuchen, W., Buchwald, H., Strolenberg, K., Metten, J., Ann (1962), 652, 28-35).

Hexitolnicotinamid-Adenindinukleotid Lithiumsalz (8)

Das Nukleotide 7 (0,067 g, 0,2 mmol) und Adenosin-5'-(phosphor-di-n-butylphosphinothio-anhydrid) (0,211 g, 0,4 mmol) werden unter Argon in einer Mischung aus 1 ml trockenem aminfreien DMF und 3 ml Pyridin (frisch über BaO destilliert) gerührt. Die Lösungsmittel werden im Vakuum abdestilliert. Die Lösungs-/Abdestillier-Prozedur wird dreimal wiederholt. Der Rückstand wird dann in einer Mischung aus 2,4 ml abs. DMF und 3 ml abs. Pyridin gelöst. Unter Lichtausschluss und unter Argon wird auf einmal Silbernitrat (0,274 g, 1,61 mmol) zugegeben, Nach 40 h Rühren bei Raumtemperatur werden 15 ml Wasser zugegeben und es wird kurz H2S eingeleitet. Der Silbersulfid-Niederschlag wird über Celite abfiltriert. Das Filtrat wird mit 3 × mit je 5 ml Chloroform gewaschen. Vom der wässrigen Phasenextrakt wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert. Das Produkt wird durch drei Chromatographien aufgereinigt.

  1. 1) DEAE Sephadex A-25 Cellulose (18 mm × 24 cm), äquilibriert mit 0,01 M TEAB, Elution mit TEAB-Lösung (0,01→0,5 M). Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Diese Prozedur wird dreimal wiederholt.
  2. 2) DEAE Whatman DE-52 Cellulose (18 mm × 25 cm) prääquilibriert mit Wasser, Elution mit wässriger Ameisensäure (0→0,3 M). Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Diese Prozedur wird zweimal wiederholt. Die Lösung wird mit 0,1 M LiOH auf pH 6 gestellt.
  3. 3) Sephadex LH-20 Cellulose (18 mm × 31 cm) mit Wasser als Eluent. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und lyophilisiert. Diese Prozedur wird zweimal wiederholt.

Ausbeute 8 (0,026 g, 19 %) farbloses Pulver. Rf 0,5 (i-PrOH/25 %-NH4OHaq/H2O 6/4/1). Exakte Masse theor. für C22H28N7O13P2 [M+-2H] 660.1220; gefunden 660.1229. UV(H2O): λmax 259 nm. 1H NMR (500 MHz, D2O) δ 2,37 (ddd, 2J3'ax,3'eq = 15,0 Hz, 3J3'ax,4' = 11,5 Hz, 3J2',3'ax = 5,2 Hz, 1H, NH-3'ax), 2,62 (m, 2J3'ax,3'eq = 15,0 Hz, 3J2',3'eq = 2,8 Hz, ZJ3'eq,4' = 4,8 Hz, 4J1'eq,3'eq = 2,8 Hz, 1H, NH-3'eq), 3,66 (m, 3J4'5' = 9,2 Hz, 3J5',6'a = 3,1 Hz, 3J5',6'b = 3,1 Hz, 1H, NH-5'), 3,95 (ddd, 3J3',ax4' = 11,5 Hz, 3J4',5' = 9,2 Hz, 3J3'eq,4' = 4,8 Hz, 1H, NH-4'), 4,22 (dd, 2J1'ax,1'eq = 14,4 Hz, 3J1'ax,2' = 3,1 Hz, 1H, NH-1'ax), 4,24 (m, 2J5'a,5'b' = 12,1 Hz, 3J4',5'a = 3,1 Hz, 1H, AH-5'a), 4,27 (m 3J5',6' = 3,1 Hz, 2H, NH-6'), 4,28 (m, 2J5'a,5'b = 12,1 Hz, 3J4',5b = 3,1 Hz, 1H, AH 5'b), 4,40 (m, 3J3',4' = 3,1 Hz, 3J4',5'a = 3.1 Hz, 3J4',5'b = 3,1 Hz, 4J4',P = 1,9 Hz, 1H, AH-4'), 4,53 (dd, 3J2',3' = 4,7 Hz, 3J3',4' = 3,1 Hz, 1H, AH-3'), 4,57 (ddd, 2J1'ax,1'eq = 14,4 Hz, 3J1'eq,2' = 2,6 Hz, 4J1'eq,3'eq = 2,8 Hz, 1H, NH-1'eq), 4,74 (t, 3J1',2' = 3,1 Hz, 3J2',3' = 3,1 Hz, 1H, AH-2'), 5,20 (m, 3J2',3'ax = 5,1 Hz, 3J2',3'eq = 2,8 Hz, 3J1'ax,2' = 3,1 Hz, 3J1'eq,2' = 2,6 Hz, 1H, NH-2'), 6,14 (d, 3J1',2' = 5,4 Hz, 1H, AH-1'), 8,25 (dd, 3J4,5 = 8,3 Hz, 3J5,6 = 6,1 Hz, 1H, NH-5), 8,40 (s, 1H, AH-2), 8,60 (s, 1H, AH-8), 8,89 (dd, 3J4,5 = 8,3 Hz, 4J2,4 = 1,5 Hz, 1H, NH-4), 9,37 (d, 3J5,6 = 6,1 Hz, 4J2,6 = 1.5 Hz, 1H, NH-6), 9,45 ppm (t, 4J2,4 = 1,5 Hz, 4J2,6 = 1,5 Hz, 1H, NH-2). 13C NMR (125 MHz, D2O) δ 38,39 (NC-3'), 62,59 (NC-4'), 67,45 (dd, 2J6',P = 4,9 Hz, 4J6',P = 2,8 Hz, NC-6'), 67,86 (dd, 2J5',P = 3,7 Hz, 4J5',P = 2,8 Hz, AC-5'), 69,59 (NC-2'), 69,78 (NC-1'), 73,02 (AC-3'), 77,37 (AC-2'), 83,22 (d, 3J5',P = 7,9 Hz, NC-5'), 86,89 (d, 3J4',P = 8,7 Hz, AC-4'), 90,49 (AC-1'), 121,20 (AC-5), 131,48 (NC-5), 136,76 (NC-3), 144,73 (AC-8), 146,72 (NC-2), 147,04 (NC-4), 148,73 (NC-6), 149,22 (AC-4), 151,15 (AC-2), 153,44 (AC-6), 168,50 ppm (CONH2).

31P NMR (202 MHz, D2O) δ -10,70 (d, 2JPP = 20,5 Hz, 1P, AP), -10,31 ppm (d, 2JPP = 20,5 Hz, 1P, NP).

1,5-Anhydro-2-azido-4,6-O-benzyliden-2-deoxy-D-altritol (10)

Zu einer Lösung von 1,5:2,3-Anhydro-4,6-O-benzyliden-D-allitol (Allart B. et al., Tetrahedron, 1999, 55, 6527-6546) 9 (1,000 g, 4,27 mmol) in einer Mischung aus 2-Methoxyethanol und Wasser 5:1 (240 ml) wird Natriumazid (1,500 g, 23,07 mmol) und Ammoniumchlorid (1,500 g, 28,04 mmol) gegeben. Die Mischung wird bei 100 °C 18 h unter Stickstoff gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird dreimal mit 100 ml warmem CHCl3 und dann mit CH2Cl2 (100 ml) diggeriert. Die vereinigten Extrakte werden über eine kurze Silica- Gel-Säule filtriert. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 10 (1,126 g, 95 %) schwach gelbes Öl. Rf 0,7 (CH2Cl2 /MeOH 98/2). + ESI MS: m/z 278.0 [M+H]+, m/z 300,0 [M+Na]+. 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 2,46 (d, 3J = 1,5 Hz, 1H, OH), 3,68-3,94 (m, 5H), 4,05 (dd, J = 13 Hz, J= 2 Hz, 1H), 4,13 (br.s, 1H), 4,32 (m, 1H), 5,65 (s, 1H, PhCH), 7,35-7,55 ppm (m, 5H, aromatiisches H).

1,5-Anhydro-2-azido-2-deoxy-D-altritol (11).

Eine Lösung von 10 (1,116 g, 4,02 mmol) in 180 ml 80 % Eisessig wird 2 h bei 95 °C gerührt. Nach Evaporation mittels Rotationsverdampfer wird in Wasser gerührt und erneut evaporiert. Dann wird mit Toluol gerührt und erneut evaporiert. Der Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt (30 -90 % EtOAc in Hexan). Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird mit CHCl3 gewaschen und im Vakuum über P2O5 getrocknet.

Ausbeute 11 0,505 g (66 %). Rf 0,1 (Hexan/EtOAc 1:2) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6), δ 3,38-3,45 (m, 3H, H-4, H-5, H-6a), 3,62 (overl. m, 1H, H-6b), 3,64 (overl. m.,Δ ν1/2= 6 Hz, 1Heq, H-2), 3,656 (d, 2J1ax,1eq = 12,2 Hz, 1H, H-1ax), 3,722 (brs, Δν1/2= 10 Hz, 1Heq, H-3), 3,748 (dd, 2J1eq,1ax = 12,2 Hz, 3J1eq,2 = 1,5 Hz, 1H, H-1eq), 4,457 (brt, 1H, 6-OH), 4,690 (d, J4,OH = 4,6 Hz, 1H, 4-OH), 5,214 ppm (d, J3,OH = 4,1 Hz, 1H, 3-OH). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6), δ 61,15 (CH, C-2), 61,45 (CH2, C-6), 63,05 (CH2, C-1), 65,8 (CH, C-4), 68,21 (CH, C-3), 77,21 ppm (CH, C-5).

1,5-Anhydro-2-azido-2-deoxy-6-O-phosphono-D-altritol Diammoniumsalz (12)

Phosphat 12 wird analog Phosphat 5 ausgehend von Azid 11 (0,503 g, 2,66 mmol) hergestellt. Grobreinigung durch Säulenchromatographie und Kieselgel (0,35 % Ammoniak (20 % wässrige Lösung in i-PrOH) schwach gelbes Öl 12 (0,353 g, 46 %). Rf 0,4 (i-PrOH/25 %-NH4OHaq/H2O 6/4/1). Dieses Produkt wird ohne weitere Aufreinigung eingesetzt.

1,5-Anhydro-2-amino-2-deoxy-6-O-phosphono-D-altritol Dinatriumsalz (13)

Zu einer Lösung des Azids 12 (0,353 g, 1,31 mmol) in 15 ml Wasser werden 25 ml Methanol und Adamskatalysator (PtO2·H2O, 0,000 g, 0,28 mmol) gegeben. Die Mischung wird 85 h in einer Parr-Hydrogenationsaparatur (30 psi) geschüttelt. Der Katalysator wird abfiltriert und vom Filtrat das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und auf eine Dowex 50WX4-400 (Na+) Ionenaustauscher-Säule aufgetragen und mit Wasser eluiert. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird im Vakuum über P2O5 getrocknet.

Ausbeute 13 (0,342 g, 91 %) schwach gelbes amorphes Pulver. Rf 0,25 (i-PrOH/25 %-NH4OHaq/H2O 6/4/1). 1H NMR (500 MHz, D2O) δ 3,489 (m, 1H, H-2), 3,725 (dt, 3J5,4 = 9,1 Hz, 3J5,6a = 3J5,6b = 3,4 Hz, 1H, H-5), 3,821 (d, 2J1ax,1eq = 13,2 Hz, 1H, H-1ax), 3.863 (dd, 3J4,5 = 9,1 Hz, 3J4,3 = 3,2 Hz, 1H, H-4), 3,938 (dd, J6,5 = 3,4 Hz, J6,P = 6,0 Hz, 2H, H-6), 3,967 (dd, 2J1eq,1ax = 13,2 Hz, 3J1eq,2 = 1,7 Hz, 1H, H-1eq), 4,197 ppm (t, 3J3,2 = 3J3,4 = 3,2 Hz, 1H, H-3). 13C NMR (125 MHz, D2O) δ 54,02 (CH, C-2), 65,49 (CH2, C-6), 66,05 (CH2, C-1), 66,11 (CH, C-4), 69,07 (CH, C-3), 78,69 ppm (d, 3J5,P = 7,3 Hz, CH, C-5). 31P NMR (202 MHz, D2O) δ 3,921 ppm.

1,5-Anhydro-2-(3-carbamoylpyridinium)-2-deoxy-6-O-phosphono-D-altritol (14)

wird in 42 % Ausbeute analog zu 7 ausgehend vom Amin 13 (0,100 g, 0,35 mmol, Lösung in 4 ml MeOH und 5 ml Wasser ), Zincke Salz Cl (0,201 g, 0,62 mmol, Lösung in 2,1 ml H2O) und 0,6 ml wässriger 0,5 M TEAB-Lösung hergestellt.

Rf 0,15 (i-PrOH/25 %-NH4-OHaq/H2O 6/4/1). 1H NMR (200 MHz, D2O) δ 4,02-4,23 (m, 4H), 4,40 (dd, 2J1'ax,1'eq = 13 Hz, 3J1'ax,2' = 4 Hz, 1H, H-1'ax), 4,54 (dd, 2J1'ax,1'eq = 13 Hz, 3J1'eq,2' = 4 Hz, 1H, H-1'eq), 4,60 (dd, 3J2',3' = 6,5 Hz, 3J3'4' = 2 Hz, 1H, H-3'), 5,04 (dt, 3J1'ax,2' = 4 Hz, 3J1'eq,2' = 4 Hz, 3J2',3' = 6,5 Hz, 1H, H-2'), 8,30 (dd, 3J4,5 = 8 Hz, 3J5,6 = 7 Hz, 1H, H-5), 8,99 (d, 3J4,5 = 8 Hz, 1H, H-4), 9,37 (d, 3J5,6 = 7 Hz, 1H, H-6), 9,51 ppm (s, 1H, H-2).

Altritolnicotinamin-Adenindinukleotid Lithiumsalz (15)

Das Nukleotid 14 (0,051 g, 0,15 mmol) wird unter Argon in einer Mischung aus 2,5 ml trockenem Formamid (pA grade) und 1 ml Pyridin (frisch über BaO destilliert) gerührt. Die Lösungsmittel werden im Vakuum abdestilliert. Die Lösungs-/Abdestillierprozedur wird dreimal wiederholt. Adenosin-5'-(phosphor-di-n-butylphosphinothio-anhydrid) (0,155 g, 0,30 mmol) wird zugegeben und die Mischung dreimal mit abs. Pyridin coevaporiert. Der Rückstand wird dann in 2,0 ml abs. Pyridin gelöst. Unter Lichausschluss und unter Argon wird auf einmal Silbernitrat (0,200 g, 1,18 mmol, bei 120 °C 2 h getrocknet) zugegeben. Nach 65 h Rühren bei Raumtemperatur werden 15 ml Wasser zugegeben und dann wie bei 8 weiterverfahren.

Ausbeute Lithiumsalz 15 (0,039 g, 39 %) farbloses Pulver. Rf 0,4 (i-PrOH/25 %-NH4OHaq/H2O 6/4/1). Mass theor. für C22H28N7O14P2 [M+-2H] 676.1169; gefunden 676.1147. -ESI MS: m/z 676 [M+ -2H]-, m/z 698 [M+ -3H+Na]-; +ESI MS: m/z 678 [M+], m/z 700 [M+-H+Na]. UV(H2O): λmax 259 nm. 1H NMR (500 MHz, D2O) δ 4,10 (m, 1H, NH-5'), 4,10 (m, 3J3',4' = 5,8 Hz, 1H, NH-4'), 4,24 (m, 2J5'a,5'b = 11,7 Hz, 3J4',5'a = 3,3 Hz, 1H, AH-5'a), 4,27 (m, 2J5'a,5'b = 11,7 Hz, 3J4',5'b = 2,6 Hz, 1H, AH-5'b), 4,29 (m, 2H, NH-6'), 4,36 (dd, 2J1'ax,1'eq = 13,2 Hz, 3J1'ax,2' = 4,1 Hz, 1H, NH-1'ax), 4,41 (m, 3J3',4' = 3,2 Hz, 3J4',5a' = 3,3 Hz, 3J4',5'b = 2,6 Hz, 1H, AH-4'), 4,46 (dd, 2J1'ax,1'eq = 13,2 Hz, 3J1'eq,2' = 4,6 Hz, 1H, NH-1'eq), 4,53 (dd, 3J3',4' = 5,8 Hz, 3J2',3' = 2,7 Hz, 1H, NH-3'), 4,53 (dd, 3J2',3' = 5,1 Hz, 3J3',4' = 3,2 Hz, 1H, AH-3'), 4,77 (dd, 3J1',2' = 5,7 Hz, 3J2',3' = 5,1 Hz, 1H, AH-2'), 5,02 (ddd, 3J1'ax,2' = 4,1 Hz, 3J1'eq,2' = 4,6 Hz, 3J2',3'eq = 2,7 Hz, 1H, NH-2'), 6,13 (d, 3J1',2' = 5,7 Hz, 1H, AH-1'), 8,25 (dd, 3J4,5 = 8,3 Hz, 3J5,6 = 6,0 Hz, 1H, NH-5), 8,31 (s, 1H, AH-2), 8,53 (s, 1H, AH-8), 8,91 (dd, 3J4,5 = 8,3 Hz, 4J2,4 = 1,5 Hz, 1H, NH-4), 9,30 (dd, 3J5,6 = 6,0 Hz, 4J2,6 = 1,5 Hz, 1H, NH-6), 9,44 (t, 4J2,4 = 1,5 Hz, 4J2,6 = 1,5 Hz, 1H, NH-2). 13C NMR (125 MHz, D2O) δ 66,40 (NC-1'), 67,66 (dd, 2J6',P = 5,0 Hz, NC-6'), 67,86 (d, 2J5',P = 6,4 Hz, AC-5'), 68,00 (NC-4'), 72,12 (NC-3'), 73,08 (NC-2'), 73,17 (AC-3'), 77,07 (AC-2'), 79,41 (d, 3J5',P = 6,9 Hz, NC-5'), 86,67 (d, 3J4',P = 7,5 Hz, AC-4'), 89,91 (AC-1'), 121,23 (AC-5), 131,63 (NC-5), 136,80 (NC-3), 144,26 (AC-8), 146,75 (NC-2), 147,71 (NC-4), 148,95 (NC-6), 151,16 (AC-4), 151,46 (AC-2), 153,35 (AC-6), 165,67 ppm (CONH2). 31P NMR (202 MHz, D2O) δ -10,68 ppm.

(1S, 4R, 5S)-N-(5-hydroxy-4-hydroxymethyl-5,7-O-benzyliden-2-cyclohexen-1-yl)phtalimid (17)

Unter Stickstoff wird eine Lösung von DIAD (5,3 ml, 25,52 mmol) in abs. THF (50 ml) langsam unter Rühren bei Raumtemperatur zu einer Suspension von Triphenylphosphin (7 g, 26,68 mmol), Verbindung 16) beschrieben unter Wang J. et al. (J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-8482 oder Gu P. et al., Tetrahedron, 2004, 60, 2111-2123) (4,2 g, 18,08 mmol) und Phtalimid (4 g, 27,18 mmol) in trockenem THF (170 ml) gegeben. Nach 1 h Rühren wird am Rotationsverdampfer. Der Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt (EtOAc/Hexan 2/8). Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 17 5,23 g, (80 %) farbloser Festkörper. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 2,14-2,18 (1H, m, J6,6' = 13,9 Hz, J6,1 = 4,1 Hz, H6), 2,26-2,32 (1H, m, H6'), 2,51 (1H, m, H4), 3,86 (1H, m, 2J= 11,1 Hz, H7), 4,35-4,38 (1H, dd, J = 10,7 Hz, J = 4,4 Hz, H7'), 4,44-4,49 (1H, m, H5), 5,11 (1H, m, H1), 5,65-5,7 (3H, m, H2, H3, CHϕ) 7,34-7,3 (9H, Harom) C22H19NO4 (361): ESI: 362 (M+H)+, 384 (M+Na)+.

(1S, 4R, 5S)-N-(5-hydroxy-4-hydroxymethyl-2-cyclohexen-1-yl)phtalimid (18)

Eine Suspension von 17 (1,116 g, 4,02 mmol) in 80 ml 80 % Eisessig wird solange bei 95 °C gerührt, bis eine klare Lösung entsteht. Nach Evaporation mittels Rotationsverdampfer wird in Wasser gerührt und erneut evaporiert. Dann wird mit Toluol gerührt und erneut evaporiert. Der Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt (EtOAc/Hexan von 1/1 auf 7/3). Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 18 3,4 g, (90 %). 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 1,76 (1H, m, H4), 2,16 (2, m, H6), 3,41(2H, m, H7 + H7'), 4,04 (1H, m, H-5), 4,69 (1H, 7-OH), 4,76 (1H, d, J = 3,5 Hz, 3-OH), 4,94 (1H, m, H1), 5,63 (1H, m, H3), 5,67 (1H, m, H2), 7,83 (4H, Hpht.) C15H15NO4 (273): ESI: 274 (M)+H)+ 296 (M+Na)+.

(1S, 4R, 5S)-1-Amino-4-O-phosphonomethyl-5-hydroxy-2-cyclohexen Ammoniumsalz (20)

Zu Trimethylphosphat (5,5 ml) wird bei 0 °C unter Argon und unter Rühren Phosphorusoxychlorid (436 µl) gegeben. Nach 15 min Rühren bei 0 °C wird 18 (600 mg, 2,19 mmol) auf einmal zugegeben. Nach 3 h Rühren werden 50 ml kaltes Wassser zugegeben und mit Triethylamin tropfenweise neutralisiert. Die Mischung wird am Rotationsverdamper im Vakuum bis zur Trockene evaporiert. Der Rückstand wird mit Diisopropylether gewaschen und säulenchromatographisch an Kieselgel mit iPrOH/NH4OH/H2O (6/3/1) als Eluent gereinigt. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 19 als farbloser Festkörper (475 mg, 56 %).

19 (300 mg, 0,775 mmol) wird in 15 ml einer EtOH/H2O (1/1) gelöst und mit Hydrazinmonohydrat (75 µl, 1,55 mmol) versetzt. Nach Rühren über Nacht bei 90 °C werden die Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und mit Essigester gewaschen. Von der wässrigen Phase wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird mit Diisopropylether gewaschen und säulenchromatographisch an Kieselgel mit iPrOH/NH4OH/H2O (6/3/1) als Eluent gereinigt. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 20 (111 mg, 56 %). 1H-NMR (D2O, 500 MHz) δ 2,026 (ddd, J6,6' = 13,9 Hz, J6,5 = 6,6 Hz, J6,1 = 3,2 Hz, 1H, H6), 2,50 (ddd, J6,6' = 13,9 Hz, J6',5 = 8,1 Hz, J6',1 = 5,8 Hz, 1H, H6'), 2,43 (m, 1H, H4), 3,863 (dt, J7,7' = 10,2 Hz, J7,5 = J7,P = 5,6 Hz, 1H, H7), 3,976 (dt, J7,7' = 10,2 Hz, J7',5' = J7',P = 5,1 Hz, 1H, H7'), 4,032 (m, 1H, H1), 4,148 (ddd, J5,6' = 8,2 Hz, J5,4 = 5,1 Hz, J5,6 = 3,3 Hz, 1H, H5), 5,855 (dt, J3,2 = 10,2 Hz, J3,4 = J3,1 = 2,5 Hz, 1H, H3), 6,004 ppm (dm, J2,3 = 10,2 Hz, 1H, H2). 31P-NMR (D2O, 202 MHz) δ 1,95 ppm(s). Exakte Masse theor. C7H13NO5P :222,1477, gef. 222.0523.

(1S, 4R, 5S)-1-(Carbamoylpyridin)-4-phosphonomethyl-5-hydroxy-2-cyclohexen Triethylammoniumsalz (21)

20 (0,07 g, 0,26 mmol) wird in einer Mischung aus MeOH (4,5 ml) und trockener Hünig Base iPr2EtN (0,09 ml, 0,52 mmol) 30 min bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Zincke BF4- Salz (0,1 g, 0,28 mmol) wird auf einmal zugegeben. Die tiefrote Mischung wird 5 h bei 55 °C gerührt und es werden weitere 0,03 g des Zincke Tetrafluoroboratsalzes zugegeben und weitere 20 h erhitzt. Es werden 50 ml einer TEAB (1 M)-Lösung zugegeben und am Rotationsverdampfer unter Vakuum bis zur Trockene eingedampft. Das Rohprodukt wird durch MPLC an DEAE-Cellulose gereinigt. Zuerst werden unerwünschte Nebenprodukte mit Wasser eluiert. Dann wird mit einem Gradient von 0,01 M TEAB auf 0,5 M TEAB mit einem Fluss von 1 ml/min weitereluiert. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 21 0,09 g, (92 %): farbloses amorphes Pulver. 1H-NMR (D2O, 500 MHz) δ 2,31-2,35 (ddd, J6',6" = 13,8 Hz, J6',5' = 6,6 Hz, J6,1' = 3,1 Hz, 1H, H6'), 2,48-2,54 (dm, J6,6' = 13,8 Hz, 1H, H6"), 2,59 (m, 1H, H4'), 4,05-4,11 (m, 3H, H7', H7", H5'), 5,67 (m, 1H, H1'), 6,05 (m, 1H, H3'), 6,41 (dm, J2,3 = 11,5 Hz, 1H, H2'), 8,22 (dd, J5,4 = 8 Hz, J5,6 = 6 Hz, 1H, H5), 8,92 (d, J4,5 = 8 Hz, 1H, H4), 9,12 (d, J6,5 = 6,1 Hz, 1H, H6), 9,35 (s, 1H, H2). 31PNMR (D2O, 202 MHz) δ 1,02 ppm(s). Exakte Masse theor. C13H16N2O6P: 327.2514, gef. 327.0739.

Cyclohexenylnicotinamid-adenin-dinukleotid Triethylammoniumsalz (22)

Zum Mononukleotid 21 (0,095 g, 0,178 mmol) und Adenosin-5'-(phosphor-di-n-butylphosphinothio-anhydrid) (0,186 g, 0,356 mmol) werden 9 ml einer 1:1 Mischung aus DMF/Pyridin gegeben. Die Lösemittel werden im Vakuum abdestillert und es wird erneut in 9 ml einer 1:1 Mischung aus DMF/Pyridin aufgenommen. Dies Prozedur wird noch einmal wiederholt. Der Rückstand wird dann gründlich im Hochvakuum getrocknet und dann wieder in 9 ml einer 1:1 Mischung aus DMF/Pyridin aufgenommen Unter Lichtausschluss und unter Argon wird auf einmal Silbernitrat (0,242 g., 1,424 mmol) zugegeben. Nach 15 h Rühren bei Raumtemperatur werden 30 ml Wasser zugegeben und es wird kurz H2S eingeleitet. Der Silbersulfid-Niederschlag wird über Celite abfiltriert. Das Filtrat wird mit 3 x mit je 5 ml Chloroform gewaschen. Von der wässrigen Phase wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer im Vakuum abdestilliert. Das Rohprodukt wird durch mit MPLC an DEAE-Cellulose gereingt. Zuerst werden unerwünschte Nebenprodukte mit Wasser eluiert. Dann wird mit einem Gradient von 0,01 M TEAB auf 0,25 M TEAB mit einem Fluss von 1 ml/min weitereluiert. Von den vereinigten Produktfraktionen wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 22 0,018 g, (12 %): farbloses Pulver. 1H-NMR (D2O, 500 MHz) δ 2,23 (1H, ddd, JNH6'-NH6" = 14 Hz, JNH6'-NH5'1 = 8,3 Hz, JNH6'-NH1' = 6 Hz, NH6'), 2,39 (1H, ddd, JNH6'-NH6" = 14,2 Hz, JNH6"-NH1' = 6,2 Hz, JNH6"-NH5' = 3,1 Hz, NH6"), 2,48 (1H, m, JNH5'-NH4' = 5,5 Hz, JNH4'-NH7' = 4,5 Hz, JNH4'-NH3' = 3,1 Hz, JNH4'-NH2' = 2,8 Hz, NH4'), 4,04 (1H, ddd, JNH5'-NH6' = 8,3 Hz, JNH5'-NH4' = 5,5 Hz, JNH5'-NH6" = 3,1 Hz NH5'), 4,09-4,14 (2H, dAB, JNH7'-NH7" = 10,6 Hz, JNH7'-NH4' = 4,5 Hz, JNH7"-NH4' = 3,8 Hz, NH7'-NH7"), 4,20-4,23 (2H, dAB, JAH5'-AH5" = 11,9 Hz, JAH5'-AH4' = 3,1 Hz, JAH5"-AH4' = 3,5 Hz, AH5'-AH5"), 4,37 (1H, m, JAH4'-AH3' = 3,2 Hz, JAH4'-AH5' = 3,1 Hz, JAH4'-AH5" = 3,5 Hz, AH4'), 4,50 (1H, dd, JAH3'-AH2' = 5,6 Hz, JAH3'-AH4' = 3,2 Hz, AH3'), 4,75 (1H, dd, JAH2'-AH1' = 5,9 Hz, JAH2'-AH3' = 5,6 Hz, AH2'), 5,57 (1H, m, JNH1'-NH6" = 6,2 Hz, JNH1'-NH6' = 6,0 Hz, JNH1'-NH2' = 2,8 Hz, JNH1'-NH3' = 1,6 Hz, NH1'), 5,90 (1H, m, JNH2'-NH3' = 10,2 Hz, JNH2'-NH4' = 2,8 Hz, JNH2'-NH1' = 2,8 Hz, NH2'), 6,06 (1H, d, JAH1'-AH2' = 5,9 Hz, AH1'), 6,28 (1H, m, JNH3'-NH2' = 10,2 Hz, JNH3'-NH4' = 3,1 Hz, JNH3'-NH1' = 1,6 Hz, NH3'), 8,15 (1H, dd, JNH5-NH4 = 8,1 Hz, JNH5-NH6 = 6,2 Hz, NH5), 8,19 (1H, s, AH8), 8,45 (1H, s, AH2), 8,80 (1H, d, JNH4-NH5 = 8,1 Hz, NH4), 9,00 (1H, d, JNH6-NH5 = 6,2 Hz, NH6), 9,27 ppm (1H, m, JNH2-NH4 = 1,5 Hz, JNH2-NH6= 1,5 Hz, NH2).

13C-NMR (D2O, 125 MHz) δ 38,53 (NC6'), 46,10 (NC4', d, JNC4'-NP = 8,8 Hz), 66,00 (NC5'), 68,01 (NC7', d, JNC7'-NP = 5,8 Hz), 68,18 (AC5', d, JAC5'-AP = 4,8 Hz), 69,88 (NC1'), 73,07 (AC3'), 76,75 (AC2'), 86,61 (AC4', d, JAC4'-AP = 8,7 Hz), 89,50 (AC1'), 121,16 (AC5), 125,08 (NC2'), 131,26 (NC5), 136,53 (NC3), 139,57 (NC3'), 142,54 (AC8), 145,98 (NC2), 147,12 (NC4), 148,04 (NC6), 155,45 (AC2), 158,04 (AC4), 158,08 (AC6), 168,13 ppm (CONH2). 31P-NMR (D2O, 202 MHz) δ -10,88 (1P, d, JNP-AP = 20,4 Hz, NP), -10,57 ppm (1P, d, JNP-AP = 20,4 Hz, AP).

Theor. Masse C23H29N7O12P2: 657.471, gef.: 657.1313