Title:
Mutierte DNA-Polymerase mit erhöhter Reverse Transkriptase Aktivität
Kind Code:
A1


Abstract:

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Reverse Transkriptase Aktivität, welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäuresequenz aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung der DNA-Polymerase. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Nukleinsäure und ein Kit, welches die DNA-Polymerase enthält.




Inventors:
Marx, Andreas, Prof. Dr. (Konstanz, 78462, DE)
Sauter, Katharina (Konstanz, 78464, DE)
Application Number:
DE102006025154
Publication Date:
12/06/2007
Filing Date:
05/30/2006
Assignee:
Universität Konstanz (Konstanz, 78464, DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE60112746T2N/A2006-05-18



Foreign References:
200501239402005-06-09
200302286162003-12-11
63993202002-06-04
WO2004039947A22004-05-13
Attorney, Agent or Firm:
Müller-Boré & Partner, Patentanwälte, European Patent Attorneys (München, 81671)
Claims:
1. DNA-Polymerase, welche sich durch mindestens eine Mutation von ihrer Wildtyp-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine erhöhte reverse Transkriptase (RT) Aktivität aufweist.

2. DNA-Polymerase nach Anspruch 1, wobei die Wildtyp-Variante aus Thermus aquaticus (Taq) stammt und eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist.

3. DNA-Polymerase nach Anspruch 2, wobei die Aminosäure-Sequenz im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine, zwei oder mehrere der Mutationen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus L322M, L459M, S515R, 1638F, S739G, E773G und L789F, in beliebiger Kombination oder alle diese Mutationen aufweist.

4. DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA-Polymerase eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

5. Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für die DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.

6. Nukleinsäure nach Anspruch 5, mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 3.

7. Vektor, enthaltend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 5 oder 6.

8. Wirtszelle, enthaltend den Vektor nach Anspruch 7 oder die Nukleinsäure nach Anspruch 5 oder 6.

9. Verfahren zur Herstellung einer DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Schritte
(a) des Bereitstellens einer Wirtszelle nach Anspruch 8,
(b) des Züchtens der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und
(c) des Isolierens der DNA-Polymerase.

10. Verfahren zur Identifizierung einer Nukleinsäure, umfassend die DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Nukleinsäure aus einer Kontamination in einem Nahrungsmittel stammt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Nukleinsäure RNA ist und/oder aus einem Mikroorganismus stammt.

13. Verwendung der DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einem diagnostischen oder molekularbiologischen Verfahren.

14. Kit zur Verwendung in einem gemäß der in den Ansprüchen 10 bis 13 genannten Verfahren, enthaltend die DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 4.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Reverse Transkriptase Aktivität, welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäuresequenz aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung der DNA-Polymerase. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Nukleinsäure und ein Kit, welches die DNA-Polymerase enthält.

Lebensmittelinfektionen gehören heutzutage zu den ernsthaftesten öffentlichen Gesundheitsrisiken. Mit über die Jahre ansteigendem globalen Reise- und Handelsaufkommen wird das Risiko der Ausbreitung von Pathogenen ständig anwachsen. Ferner spielt die mikrobiologische Qualitätskontrolle in der Nahrungsmittelproduktion zur Vermeidung von Infektionen der Verbraucher eine immer wichtigere Rolle. Aus diesen Gründen ist die Entwicklung von schnelleren, robusteren und selektiveren Methoden zur Detektion und Charakterisierung von Mikroorganismen von herausragendem Interesse in zahlreichen Forschungsansätzen und -gebieten, in der biologische Sicherheit eine fundamentale Rolle spielt (vgl. B. Malorny et al., 2003; P. G. Lantz et al., 2000; P. M. Scheu et al., 1998; C. A. Foy et al., 2001).

Traditionelle und standardisierte Methoden zum Nachweis von unerwünschten Organismen in Nahrungsmitteln beruhen auf der Vervielfältigung verdächtiger Kolonien gefolgt von deren biochemischer und/oder serologischer Identifizierung (vgl. B. Malorny et al., 2003; P. G. Lantz et al., 2000; P. M. Scheu et al., 1998; C. A. Foy et al., 2001). Diese Methoden weisen jedoch einige Nachteile auf:

  • – Hohe Zeitdauer: der Zeitraum, der für die Auswertung und Analyse notwendig ist, kann oft mehrere Tage bis zu Wochen in Anspruch nehmen.
  • – Unzureichende Robustheit und Verlässlichkeit: Phänotypische Merkmale werden von manchen Mikroorganismen oft nicht ausreichend ausgebildet, um einen verlässlichen Nachweis führen zu können.
  • – Eingeschränkte Eignung: Lebensfähige Organismen, die nicht kultivierbar sind, können nicht nachgewiesen bzw. identifiziert werden.

Eine attraktive Alternative zu den herkömmlichen Verfahren ist der spezifische Nachweis des Genoms des jeweiligen Organismus. Genotypisierende Verfahren finden daher in der jüngeren Vergangenheit eine verbreitete Anwendung (vgl. P. Belgrader et al., 1999; H. K. Nogva et al., 2000; J. Hoorfar et al., 2000; M. Dahlenborg et al., 2001, R. Knutsson et al., 2002; C. Löfström et al., 2004). Dabei ist der Nachweis des bakteriellen Genoms durch Amplifikation mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) möglich. Nichtsdestotrotz haben diese Methoden noch signifikante Nachteile, was ihrer breiten und generellen Anwendung und Akzeptanz noch im Wege steht. So ist die Spezifität der PCR oft nicht ausreichend, um geringe Mengen bakterieller DNA in Gegenwart von DNA des Wirts nachzuweisen. Ein Grund dafür ist die häufig zu beobachtende Fehlamplifikation wie z.B. von Primerdimeren die zu falsch-positiven Signalen führt. Diese Eigenschaft ist nur durch Erhöhung der Ausgangsmenge an zu untersuchendem Material zu vermeiden und geht somit auf Kosten der Sensitivität. Ferner stellen zahlreiche Inhibitoren in Nahrungsmitteln, die eine PCR inhibieren, ein großes Problem dar (vgl. D. L. Wiedbrauck et ak., 1995) Hier sind robustere und verlässlichere Systeme zwingend erforderlich. Ein weiteres Problem ist die Unterscheidung von lebenden und abgestorbenen Organismen durch PCR-Methoden. Die Möglichkeit des Nachweises von mRNA, welche nur in lebenden Zellen vorkommt, durch eine mit reverser Transkription gekoppelten PCR (RT-PCR) zeigte bereits erste Erfolge und ihre prinzipielle Anwendbarkeit (vgl. B. K. R. Patel et al., 1993; I. Hein et al., 2001; G. E. Sheridan et al., 1998; E. A. Szabo et al., 1999; A. K. Bej et al., 1991). Sie geht aber erheblich zu Lasten der Selektivität und Sensitivität, sodass teilweise mehr als 1000-fach erhöhte Mengen an Ziel-DNA verwendet werden müssen. Auch hier sind Optimierungen dringend erforderlich.

Die wenigen bereits im Handel erhältlichen Kits (z.B. Qiagen) für die Anwendung in solchen RT-PCR-Verfahren enthalten stets zwei Enzyme (jeweils Reverse Transkriptase und DNA-Polymerase). Der Einsatz von Tth Polymerase (Roche) als einzelnes Enzym verlangt hingegen die Verwendung von Mn2+ und erfordert zudem eine aufwendige Probenmanipulation, in der das Probengefäß geöffnet werden muss, wodurch eine erhöhte Gefahr der Kontaminierung besteht.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine DNA-Polymerase bereitzustellen, welche es ermöglicht, die Anwesenheit von Mikroorganismen mit hoher Selektivität und Sensitivität ohne aufwendige Manipulationen und/oder Aufarbeitungschritte nachzuweisen.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird erfindungsgemäß eine DNA-Polymerase bereitgestellt, welche sich durch mindestens eine Mutation von ihrer Wildtyp-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine erhöhte reverse Transkriptase (RT) Aktivität aufweist.

Der Begriff "DNA-Polymerase" umfasst erfindungsgemäß alle DNA-Polymerasen, welche in einer Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise allgemein in der PCR oder der allelspezifischen Amplifikation, eingesetzt werden können. Zur Verwendung einer DNA-Polymerase beispielsweise in der PCR, weist die DNA-Polymerase vorzugsweise eine Thermostabilität innerhalb des in der PCR verwendeten Temperaturbereichs auf.

Die Begriffe "Amplifikation" bzw. "Amplifikationsreaktion" bezeichnen in diesem Zusammenhang insbesondere die Replikation bzw. Vervielfältigung einer Nukleinsäure wie beispielsweise DNA oder RNA. Desweiteren schließt die vorliegende Erfindung alle funktionell aktiven Derivate der vorstehend definierten DNA-Polymerase ein, d.h. auch solche Derivate, die geringfügige Änderungen in der Aminosäuresequenz aufweisen, welche keine wesentliche Auswirkung auf die Funktion der DNA-Polymerase haben.

Die vorliegende Erfindung umfasst in diesem Zusammenhang auch solche DNA-Polymerasen, deren Aminosäurekette entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an den Aminosäure-Seitenketten oder am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbindungen, Methylierungen und Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycolysierungen, Hydroxylierungen, Phosphorylierungen und tRNA-vermittelte Addition von Aminosäuren. Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase kann als individuelles Protein oder als Teil eines größeren Proteins, z.B. eines Fusionsproteins vorliegen. Desweiteren kann sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung und/oder Isolierung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder eine einfache Detektion ermöglichen, wie beispielweise Fluoreszenz- oder radioaktive Marker enthalten.

Der Begriff "Mutation" umfasst erfindungsgemäß jede Veränderung einer Aminosäuresequenz der Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase wie beispielsweise Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren.

Weiterhin unterliegen diese, durch Addition hinzugefügten oder durch Substitution ersetzenden Aminosäuren keiner besonderen Einschränkung und umfassen neben allen natürliche Aminosäuren auch nicht-natürliche Aminosäuren wie beispielsweise D-Aminosäuren oder Aminosäuren mit modifizierten Seitenketten.

Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase bzw. ihre Wildtyp-Variante unterliegt hinsichtlich ihrer Herkunft keiner besonderen Einschränkung, sondern kann aus jedem beliebigen Organismus stammen, wie beispielsweise aus Säugern, Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen. Vorzugsweise leiten sich die erfindungsgemässe DNA-Polymerase von bakteriellen DNA-Polymerasen, wie Polymerasen von E. coli, Aguifex, Borielia, Bacillus, Chlamydia, Chlamydophila, Chloroflexus, Haemophilis, Heliobacter, Lacococcus, Methylobakterium, Myocobakterium, Rohodothermus, Rickettsia, Streptococcus, Streptomyces, Syncechocysts, Treponema, insbesondere von Polymerasen thermostabiler Organismen wie Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus fliformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus stearofhermophilus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis, Pyrococcus furiosus ab.

Die Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase kann auch einer dem Fachmann bekannten DNA-Polymerase aus der Sequenzfamilie A entsprechen und beispielsweise aus Mikroorganismen wie Thermus aquaticus (Taq), E. coli, Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Rhodofhermus obamensis, Bacillus stearothermophilus stammen.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq) und weist eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 auf. Dies schließt auch modifizierte Formen der Taq DNA-Polyermase ein, wie beispielsweise die verkürzte Form Klentaq DNA-Polymerase.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Aminosäure-Sequenz der vorstehend definierten DNA-Polymerase im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine, zwei oder mehrere der Mutationen L322M, L459M, S515R, 1638F, S739G, E773G, L789F in beliebiger Kombination oder alle diese Mutationen auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die DNA-Polymerase eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 auf.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für die erfindungsgemäße DNA-Polymerase kodiert. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform, weist die vorstehend definierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 3 auf.

Desweiteren wird erfindungsgemäß ein Vektor, enthaltend die vorstehend definierte Nukleinsäure, bereitgestellt. Der erfindungsgemäße Vektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wobei geeignete Vektoren im Stand der Technik bekannt sind. Der Vektor ist vorzugsweise zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle befähigt. Dazu enthält der Vektor vorzugsweise geeignete regulatorische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminations-Sequenzen usw. Der Vektor kann auch zur stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle verwendet werden. Beispiele geeigneter Vektoren sind pET15b, pET21b, pTTQ18, pASK-IBA37plus und pET30 Xa Lic.

Ein weiterer Gegenstand betrifft erfindungsgemäß eine solche Wirtszelle, enthaltend den vorstehend definierten Vektor oder die vorstehend definierte Nukleinsäure.

Der hierin verwendete Ausdruck "Wirtszelle" unterliegt keiner besonderen Einschränkung und umfasst sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Zellen, welche zur Produktion heterologer Proteine geeignet und im Stand der Technik bekannt sind. Dies sind beispielsweise Säugerzellen, tierische Zellen Pflanzenzellen oder Zellen von Mikroorganismen. Die erfindungsgemäße Wirtszelle ist vorzugsweise eine Zelle welche von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, wie beispielsweise E. coli, Saccharomyces, sowohl prokaryontische Zellen, wie E. coli (insbesondere E. coli XI1-blue, DH5α, B121 (DE3), M15 [pREP4], SG13005 (pREP4], BL21 (DE3)pLysS), Halomonas elongata, Caulobacter sp. Halobacteriumhalobium, als auch eukaryontische Zellen, wie Hefe- und andere Pilzzellen, pflanzliche und tierische Zellen, einschliesslich isolierter menschlicher Zellen, die sich in Zellkultur befinden. Des Weiteren werden unter dem Begriff "Wirtszelle" auch Zellextrakte verstanden, die bei Vorlage einer mRNA diese translatieren können, wie Weizenkeimextrakt als auch Kaninchen-Reticulocytenextrakt. Weiterhin werden hier auch in vitro Expressionssysteme als "Wirtszelle" verstanden, wie z. B. das T7 Expression System pBAD Expression System, ThioFusion" Expression Systems, trc Expression System, PL Expression System, PurePro Caulobacter Expression System, Microbiological Media and Media Components, Qiagen pQE Expression System und das Novagen pET Expression System.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase, umfassend die Schritte

  • (a) des Bereitstellens einer wie vorstehend definierten Wirtszelle,
  • (b) des Züchtens der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und
  • (c) des Isolierens der DNA-Polymerase.

Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase wird vorzugsweise durch Expression mit Hilfe geeigneter Expressionsysteme, vorzugsweise als sezerniertes Produkt selektionierbarer stabiler Transfektanden der Zelllinie E. coli BL21 (DE3) pLysS, hergestellt.

Die vorliegende Erfindung schließt alle im Stand der Technik bekannten Techniken zum Züchten von Zellen ein. Ebenso unterliegt der hierin verwendete Begriff "Isolieren" keiner besonderen Einschränkung und beinhaltet alle dem Fachmann bekannten Techniken zum Isolieren rekombinant hergestellter Peptide, Proteine und Nukleinsäuren, wie beispielsweise Elektrophorese, Gelfiltration, Mikrofiltration, Mikrodiafiltration, Dialyse, chromatographische Verfahren, Zentrifugation usw.

Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Nukleinsäure bereit, umfassend die vorstehend definierte DNA-Polymerase.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, stammt die vorstehend definierte Nukleinsäure aus einer Kontamination in einem Nahrungsmittel.

Der Begriff "Kontamination" schließt alle Verunreinigungen ein, die in einem Nahrungsmittel auftreten können, beispielsweise Verunreinigungen, welche durch die Herstellung, die Verarbeitungen, die Lagerung oder die Verwendung des Nahrungsmittels eingeführt werden können. Insbesondere schließt der Begriff "Kontamination" Mikroorganismen wie Bakterien, Viren, Pilze usw. ein.

Der hierin verwendete Begriff "Nahrungsmittel" unterliegt in diesem Zusammenhang keiner besonderen Einschränkung und kann ein Nahrungsmittel, eine Nahrungsergänzungsmittel oder ein Futtermittel sein. Desweiteren schließt der Begriff alle Nahrungsmittel ein, welche durch Mikroorganismen verunreinigt werden können wie insbesondere solche Nahrungsmittel, die Fleisch, Obst, Fisch, Molkereiprodukte, Backprodukte und Ähnliches enthalten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die vorstehend definierte Nukleinsäure in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine RNA und/oder stammt aus einem Mikroorganismus.

Der Ausdruck "Mikroorganismus", wie er hierin verwendet wird, schließt alle Mikroorganismen ein, welche in einem Nahrungsmittel enthalten sein können. Insbesondere umfasst der Begriff "Mikroorganismus" solche Mikroorganismen, die gesundheitsschädlich für den Konsumenten der Nahrung sein können.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorstehend definierten DNA-Polymerase in einem diagnostischen oder molekularbiologischen Verfahren. Ferner kann die erfindungsgemäße DNA-Polymerase zur mRNA-Quantifizierung, beispielsweise durch Echtzeit-PCR, verwendet werden. Ein Beispiel hierfür ist eine Quantifizierung der Expression bestimmter Gene.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Verwendung in einem der vorstehend genannten Verfahren bereitgestellt, enthaltend die erfindungsgemäße DNA-Polymerase, oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure. Das erfindungsgemäße Kit unterliegt jedoch bezüglich der möglichen Verwendung keiner besonderen Einschränkung und kann in allen Verfahren verwendet werden, in denen die erfindungsgemäße DNA-Polymerase einen Effekt aufweist. Desweiteren kann das Kit neben der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase auch andere Substanzen, wie beispielsweise Puffer, Indikatoren, Salze, weitere Enzyme, proteinartige Verbindungen oder Hilfsstoffe enthalten.

Aufgrund der im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens einen enthaltenden Mutation in der Aminosäure-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase, weist diese eine überraschend erhöhte Reverse Transkriptase Aktivität auf. Durch diese vorteilhaften Eigenschaft kann die erfindungsgemäße DNA-Polymerase beispielsweise in Reverse Transkriptase gekoppelten Amplifikationsverfahren (RT-PCR) eingesetzt werden und ermöglicht so den Nachweis von RNA und/oder DNA ohne den Einsatz eines weiteren Enzyms oder aufwendiger Aufarbeitungsschritt. Durch diesen überraschenden Effekt erlaubt die erfindungsgemäße DNA-Polymerase die Entwicklung neuer vorteilhafter Verfahren wie beispielsweise zum Nachweis von schädlichen Mikroorganismen in Nahrungsmitteln.

Die Figuren zeigen:

1: Aminosäure-Sequenz von Klentaq DNA-Polymerase Wildtyp.

2: Aminosäure-Sequenz der Mutante L322M, L459M, S515R, 1638F, S739G, E773G (2-O7) von Klentaq DNA-Polymerase.

3: 14 % SDS-PAGE Gel von gereinigten Polymerasen.

4: RT-PCR-Aktivität von Klentaq wt und der Mutante 2-O7 (0.8 % Agarose-Gel). Das verwendete Templat ist in der Figur gezeigt.

5: Primer-Extension-Assays mit Klentaq wt und der Mutante 2-O7 mittels eines 50mer RNA Templats (12 % PAGE Gel).

6: Primer-Extension-Assays mit Klentaq wt und der Mutante 2-O7 mittels eines RNA Templats von Roche (12 % PAGE Gel).

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1: Konstruktion der Bibliothek

Das Klentaq Wildtyp-Konstrukt wird durch Klonierung des Gens in die BsaI-Stelle von pASK-IBA37plus (IBA) erhalten. Das Insert wird sequenziert, um zu bestätigen, dass es keine Mutationen aufweist. Die Einführung zufälliger Mutationen wird mit Error-prone PCR durchgeführt. PCR-Reaktionen werden unter Verwendung von 5 Einheiten Taq DNA-Polymerase (Fermentas), 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,08% Nonidet P40, 1,5 mM MgCl2, 50 μM MnCl2, 2,5 μM von jedem dNTP, 20 pM Templat pASK-IBA37plus KTQ wt und 500 nM von jedem Primer (5'-ATG GTA CGT CTC AGC GCG CCC TGG AGG AGG CCC CCT-3' forward (SEQ ID NO: 4), 5'-ATG GTA CGT CTC ATA TCA CTC CTT GGC GGA GAG CCA GTC-3' reverse (SEQ ID NO: 5)) in einem 100 μL Gemisch durchgeführt. Es wird durch 14 PCR-Zyklen amplifiziert (95 °C für 1 min., 65 °C für 1 min. und 72 °C für 2 min.). Das Produkt (1655 bp) wird gereinigt (MinEluteTM Reaction Cleanup Kit, Qiagen) gefolgt von einer Verdauung mit BsmBI. Das Restriktionsfragment wird dann durch Elektrophorese in einem 0,8% Agarose-Gel isoliert und gereinigt (MinEluteTM Gel Extraction Kit, Qiagen). Es wird mit dem durch BsaI verdauten pASK-IBA37plus durch Inkubieren bei 22 °C für 1 Stunde mit T4 DNA Ligase (Fermentas) ligiert. Die resultierende Plasmid-Bibliothek wird in E. coli BL21 transformiert. 5000 Klone werden von Agarplatten ausgewählt und über Nacht separat in LB-Medium (100 μg/mL Carbenicillin) enthaltenden 96-well-Platten gezüchtet. Die Klentaq-Mutanten werden parallel in 1-mL-Kulturen in 96-well-Platten durch Induktion mit 200 μg/L AHT exprimiert. Lysis wird in einem 600 μL Gemisch, welches 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20, 2,5 mM MgCl2 und 1 mg/mL Lysozym enthält, durchgeführt. Das Lysat wird auf Eis für 30 min. inkubiert, gefolgt von Hitze-Denaturierung aller nicht thermostabilen Proteine bei 72 °C über 45 min. Nach dem Zentrifugieren wird das Lysat direkt zum Screenen verwendet.

Beispiel 2: Screening nach PCR-aktiven Mutanten

Reaktionsgemische (20 μL) für das Bibliotheks-Screenen enthalten 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20, 2,5 mM MgCl2, 200 μM von jedem dNTP, 20 pM Templat MS2 (100mer, 5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TTC TTC AGC GAA AAG CAC GAC AGT GGT CGC TAC ATA GCG TGG TTC CAT ACT GGA GGT GAA ATC ACC GAC AGC ATG AAG TCC G-3' (SEQ ID NO: 6)), 100 nM von jedem Primer (5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TT-3' forward (SEQ ID NO: 7), 5'-CGG ACT TCA TGC TGT CGG TG-3' reverse (SEQ ID NO: 8)) und 0,6 × SYBRgreen I (Molecular Probes). Diese werden unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeits-Manipulationsgerätes (Hamilton Microlab Star) in 384-well-Platten gegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 μL Lysat-Lösung. Als Negativ-Kontrollen werden analog behandelte Kulturen von XL10 Gold Zellen, welche den nicht-kodierenden Vektor pASK-IBA37plus enthalten, verwendet. Nach 50 PCR-Zyklen (95 °C für 30 s, 55 °C für 35 s und 72 °C für 40 s) werden die Fluoreszenz-Intensitäten mittels eines Fluoreszenzplatten-Lesers (Polarstar Optima, BMG Labtechnologies GmbH) mit einer Anregung bei 485 nm und einer Emission bei 520 nm quantifiziert.

Der anfängliche Grenzwert für die Erkennung eines Treffers war eine 1,2-fach höhere Fluoreszenz in Vergleich zu dem Wildtyp. Dieser Faktor war ausreichend, um PCR-aktive Enzyme erfolgreich zu identifizieren. Diese Mutanten wurden getrennt und weiter in einer mit reverser Transkription gekopplten PCR-Reaktion (RT-PCR) analysiert.

Beispiel 3: Screening nach Reverse Transkription (RT)-aktiven Mutanten

Die Reaktionsgemische (20 μL) enthalten 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20, 2,5 mM MgCl2, 200 μM von jedem dNTP, 50 pg/μL Templat RNA von Bacteriophage MS2 (Roche), 100 nM von jedem Primer (5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TT-3' forward (SEQ ID NO: 9), 5'-CGG ACT TCA TGC TGT CGG TG-3' reverse (SEQ ID NO: 10)) und 0,6 × SYBRgreen I (Molecular Probes). Diese werden unter Verwendung eines automatischen Flüssigkeits-Manipulationsgerätes (Hamilton Microlab Star) in 96-well-PCR-Platten gegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 μL Lysat-Lösung. Die Reaktionen werden in einem Echtzeit PCR-Cycler (iCycler, BIO-RAD) durchgeführt. Nach einem anfänglichen reversen Transkriptions-Zyklus (95 °C für 30 s, 55 °C für 35 s und 72 °C für 15 min.) und 50 PCR-Zyklen (95 °C für 30 s, 55 °C für 35 s und 72 °C für 40 s) werden aktive Mutanten durch Messen der Fluoreszenz-Schmelzkurve des amplifizierten Produkts identifiziert.

3% der PCR-aktiven Mutanten zeigten eine RT-Aktivität. Eine dieser Mutanten (2-O7) wurde gereinigt und weiter analysiert.

Beispiel 4: Reinigung von Klentaq-Mutanten

Klentaq wt und ausgewählte Mutanten werden wie oben beschrieben exprimiert und unter Verwendung von Ni-NTA Agarose (BIO-RAD) gereinigt, wobei dem Protokoll des Herstellers, unter Weglassen von Imidazol während der Lysis- und Waschschritte, gefolgt wird.

Die auf diese Weise erhaltenen Enzyme waren >95% rein, wie durch Coomassie-Blau gefärbtes SDS-PAGE bestätigt.

Nach dem Puffer-Austausch zu 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20, 2,5 mM MgCl2 und 1 mM DTT, enthaltend 50% Glycerin, werden die Konzentrationen mittels Nanoorange-Assay (Molecular Probes) gemessen (vgl. 3).

Beispiel 5: Vergleich von Klentaq wt und der Klentaq Mutante 2-O7RT-PCR-Aktivität

Die Reaktionsgemische (50 μL) enthalten 50 mM Tris-HCl (pH 9,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20, 2,5 mM MgCl2, 200 μM von jedem dNTP, 50 pg/μL Templat RNA von Bacteriophage MS2 (Roche)/20 pM Templat MS2 (100mer, 5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TTC TTC AGC GAA AAG CAC GAC AGT GGT CGC TAC ATA GCG TGG TTC CAT ACT GGA GGT GAA ATC ACC GAC AGC ATG AAG TCC G-3' (SEQ ID NO: 11)), 100 nM von jedem Primer (5'-ATC GCT CGA GAA CGC AAG TT-3' forward (SEQ ID NO: 12), 5'-ACC TCC AGT ATG GAA CCA CG-3' reverse (SEQ ID NO: 13)) und 50 nM Klentaq DNA-Polymerase. Nach einem anfänglichen reversen Transpriptions-Zyklus (95 °C für 30 s, 55 °C für 35 s and 72 °C für 15 min.) wird das Produkt durch 40 PCR-Zyklen (95 °C für 30 s, 55 °C für 35 s and 72 °C für 40 s) amplifiziert.

Wie in 4 zu sehen ist, sind sowohl die Wildtyp-Variante (wt) als auch die Mutante 2-O7 der Klentaq DNA-Polymerase PCR-aktiv wenn DNA als Templat angeboten wird. Im Gegensatz zur Wildtyp-Variante weist die Mutante 2-O7 jedoch überraschenderweise eine erheblich erhöhte reverse Transkriptase Aktivität auf und akzeptiert ebenso RNA als Templat, welches nach anfänglicher reverser Transkription in DNA effizient amplifiziert wird.

Primer-Extension-Assays mit einem RNA-Templat

Die Reaktionsgemische (30 μL) enthalten 50 mM Tris-HCl (pH 0,2), 16 mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20, 2,5 mM MgCl2, 10 μM von jedem dNTP, 150 nM Templat RNA (50mer, 5'-AUC GCU CGA GAA CGC AAG UUC UUC AGC GAA AAG CAC GAC AGU GGU CGC UA-3' (SEQ ID NO: 14), vgl. 5)/RNA von Bacteriophage MS2 (Roche, vgl. 6), 100 nM 5'-[32P] primer (5'-TAG CGA CCA CTG TCG TGC TT-3' (SEQ ID NO: 15)) und 25 nM Klenfaq DNA-Polymerase. Nach einer Inkubation bei 95 °C für 30 s, 55 °C für 35 °C und 72 °C für 15 min. bis 4 h, werden die Reaktionen durch Zugabe von 3 Volumina Gel-Beladungspuffer (80% Formamid, 20 mM EDTA) gestoppt.

Die Ergebnisse der Primer-Extension-Assays mit RNA-Templaten sind in den 5 und 6 abgebildet. Bei beiden untersuchten RNA-Templaten konnte eine überraschend erhöhte Aktivität der Mutante 2-O7 der Klentaq DNA-Polymerase gegenüber der Wildtyp-Variante beobachtet werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.