Title:
Use of long chain azo dye as blotter for fluorescent based detection reactions and as dye for optical detection e.g. in qualitative and quantitative determination procedure e.g. immune tests and hybridization procedure
Kind Code:
A1


Abstract:
Use of long chain azo dye (I) as blotter for fluorescent-based detection reactions. Use of long chain azo dye of formula (I) as blotter for fluorescent-based detection reactions. Either R, R1-R5 : H, Cl, Br, I, alkyl, (hetero)aryl, (hetero)cycloalkyl, alkyloxy, alkylmercapto, (hetero)aryloxy, (hetero)arylmercapto, NO2, carboxylic acid, carboxylic acidester, carboxylic acid amide, trifluoromethyl, trifluoroacetyl, tricyanovinyl, cyano, OH, substituted alkyl, cyclic amino functional group, solubilizing, ionizable or ionized substituents such as SO3->, PO32>->, CO2->, O->, NR3+>, cyclodextrin or sugar, which determines the hydrophilic characteristics of the dye (where these substituents bonded over (hetero)aliphatic, e.g. cyclic, spacer group on the dye), reactive groups such as isocyanate, isothiocyanate, hydrazine, amine, mono- and dichloro- and/or mono- and dibromotriazine, aziridine, (meth)acrylate, vinyl, vinylsulfonyl, sulfonylhalogenide, N-hydroxysuccinimidester, imido-ester, glyoxal, aldehyde, maleimide, iodacetamide, phosphoramide (where these substituents bonded over (hetero)aliphatic, e.g. cyclic, spacer group on the dye) or (hetero)aliphatic spacer group of formula -[(CH2)a-Y1-(CH2)b]c; or R2R3, R4R5, two adjacent groups : aliphatic or aromatic rings; X : O, S, Se, Te, (CR2)n, SO2, CR2-O-, -O-CR2, -CO-O- or -O-CO-; n : 1-4; R6 : substituted (hetero)aromatic system; Y1 : C(R)2-, O-, S-, SO2, SO2NH-, NR-, COO- or CONR; a, b : 0-18; and c : 1-18. [Image].



Inventors:
Mohr, Gerhard, Dr. rer. nat. (Jena, 07743, DE)
Application Number:
DE102005050834
Publication Date:
04/26/2007
Filing Date:
10/20/2005
Assignee:
Friedrich-Schiller-Universität Jena (Jena, 07743, DE)
International Classes:



Claims:
1. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen der allgemeinen Formel I wobei:
R1-R5 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Chlor-, Brom- und/oder Iodatome, Alkyl-, Aryl-, Hereroaryl-, Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Alkyloxy-, Alkylmercapto-, Aryloxy-, Arylmercapto-, Heteroaryloxy-, Heteroarylmercapto-, Nitro-Reste, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Carbonsäureamid-, Trifluormethyl, Trifluoracetyl, Tricyanovinyl- oder Cyano-Reste, eine oder mehrere Hydroxy-, eine oder mehrere alkylsubstituierte oder cyclische Aminofunktionen sein können und R2 und R3 und/oder R4 und R5 weitere aliphatische oder aromatische Ringe bzw. zwei benachbarte Reste zusammen einen oder mehrere aliphatische oder aromatische Ringe bilden können, X ein Element aus der Gruppe O, S, Se, Te oder das Strukturelement (CR2)n mit n = 1 – 4, NR oder SO2 sein und für die Strukturelemente -CR2-O-, -O-CR2, -CO-O- oder -O-CO- stehen kann, R6 ein substituiertes aromatisches oder heteroaromatisches System ist, welches an die in (I) angegebene Grundstruktur gebunden ist, einer oder mehrere der Substituenten R1-R5 solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte Substituenten wie SO3, PO32–, CO2, O-, NR3+ oder Cyclodextrin oder Zucker darstellen, welche die hydrophilen Eigenschaften der Farbstoffe bestimmen, wobei diese Substituenten auch über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein können, mindestens einer der Substituenten R1-R5 für eine reaktive Gruppe vom Typ Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Amin, Mono- und Dichlor- bzw. Mono- und Dibromtriazin, Aziridin, Methacrylat, Acrylat, Vinyl, Vinylsulfonyl, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd bzw. Maleimid oder Iodacetamid sowie Phosphoramidit steht, wobei der jeweilige Substituent über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein kann und die aliphatische oder hereroaliphatische Spacergruppe aus einem Strukturelement -[(CH2)a-Y-(CH2)b]c besteht, worin Y gleich oder verschieden eine CR2-, O-, S-, SO2, SO2NH-, NR-, COO- oder CONR-Funktion sein kann, wobei R gleich oder unterschiedlich die Funktionen von R1-R5 einnehmen kann und a und b gleich oder verschieden die Werte von 0-18 und c die Werte von 1-18 darstellen.
als Löscher für fluoreszenzbasierende Nachweisreaktionen.

2. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Rest R6 eine aromatische Verbindung der allgemeinen Formel II wobei:
R7-R12 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Chlor-, Brom- und/oder Iodatome, Alkyl-, Aryl-, Hereroaryl-, Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Alkyloxy-, Alkylmercapto-, Aryloxy-, Arylmercapto-, Heteroaryloxy-, Heteroarylmercapto-, Nitro-Reste, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Carbonsäureamid-, Trifluormethyl, Trifluoracetyl, Tricyanovinyl- oder Cyano-Reste, eine oder mehrere Hydroxy-, eine oder mehrere alkylsubstituierte oder cyclische Aminofunktionen sein können und R7 und R8 und/oder R11 und R12 weitere aliphatische oder aromatische Ringe bzw. zwei benachbarte Reste zusammen einen oder mehrere aliphatische oder aromatische Ringe bilden können, einer oder mehrere der Substituenten R7-R12 solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte Substituenten wie SO3, PO32–, CO2, O, NR3+ oder Cyclodextrin oder Zucker darstellen, welche die hydrophilen Eigenschaften der Farbstoffe bestimmen, wobei diese Substituenten auch über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein können, mindestens einer der Substituenten R7-R12 für eine reaktive Gruppe vom Typ Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Amin, Mono- und Dichlor- bzw. Mono- und Dibromtriazin, Aziridin, Methacrylat, Acrylat, Vinyl, Vinylsulfonyl, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd bzw. Maleimid oder Iodacetamid sowie Phosphoramidit stehen kann, wobei der jeweilige Substituent über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein kann und die aliphatische oder hereroaliphatische Spacergruppe aus einem Strukturelement -[(CH2)a-Y-(CH2)b]c besteht, worin Y gleich oder verschieden eine CR2-, O-, S-, SO2, SO2NH-, NR-, COO- oder CONR-Funktion sein kann, wobei R gleich oder unterschiedlich die Funktionen von R1 bis R5 und R7 bis R12 einnehmen kann und a und b gleich oder verschieden die Werte von 0-18 und c die Werte von 1-18 darstellen.
eingesetzt wird.

3. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Rest R6 eine aromatische Verbindung der allgemeinen Formel III wobei:
R7-R15 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Chlor-, Brom- und/oder Iodatome, Alkyl-, Aryl-, Hereroaryl-, Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Alkyloxy-, Alkylmercapto-, Aryloxy-, Arylmercapto-, Heteroaryloxy-, Heteroarylmercapto-, Nitro-Reste, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Carbonsäureamid-, Trifluormethyl, Trifluoracetyl, Tricyanovinyl- oder Cyano-Reste, eine oder mehrere Hydroxy-, eine oder mehrere alkylsubstituierte oder cyclische Aminofunktionen sein können und R7 und R8 und/oder R11 und R12 weitere aliphatische oder aromatische Ringe bzw. zwei benachbarte Reste zusammen einen oder mehrere aliphatische oder aromatische Ringe bilden können, einer oder mehrere der Substituenten R7-R15 solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte Substituenten wie SO3, PO32–, CO2, O-, NR3+ oder Cyclodextrin oder Zucker darstellen, welche die hydrophilen Eigenschaften der Farbstoffe bestimmen, wobei diese Substituenten auch über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein können, mindestens einer der Substituenten R7-R15 für eine reaktive Gruppe vom Typ Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Amin, Mono- und Dichlor- bzw. Mono- und Dibromtriazin, Aziridin, Methacrylat, Acrylat, Vinyl, Vinylsulfonyl, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd bzw. Maleimid oder Iodacetamid sowie Phosphoramidit stehen kann, wobei der jeweilige Substituent über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein kann und die aliphatische oder hereroaliphatische Spacergruppe aus einem Strukturelement -[(CH2)a-Y-(CH2)b]c besteht, worin Y gleich oder verschieden eine CR2-, O-, S-, SO2, SO2NH-, NR-, COO- oder CONR-Funktion sein kann, wobei R gleich oder unterschiedlich die Funktionen von R1 bis R5 und R7 bis R15 einnehmen kann und a und b gleich oder verschieden die Werte von 0-18 und c die Werte von 1-18 darstellen.
eingesetzt wird.

4. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche als Farbstoffe zur optischen Markierung insbesondere von Proteinen, Nukleinsäuren, Oligomeren, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Mono-, Oligo- und Polysacchariden, Liganden, Rezeptoren, Polymeren, Pharmaka sowie Polymerpartikeln.

5. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Proteinen, Nukleinsäuren, Oligomeren, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren, Pharmaka und Polymerpartikeln die funktionellen Gruppen der Azofarbstoffe kovalent an eine HO-, H2N- oder HS-Funktion der zu bestimmenden Substanzen gekoppelt werden.

6. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplungsreaktion in organischen oder wässrigen Lösungen durchgeführt wird.

7. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung durch Ausbildung von ionischen Wechselwirkungen zwischen den Azofarbstoffen und den zu markierenden Materialien erfolgt.

8. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren, beispielsweise Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischen oder elektrophoretischen Verfahren, sowie im Hoch-Durchsatz-Screening.

9. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche zur Analyse von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen auf einem Mikroarray.

10. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Erkennungseinheiten, wie Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Antigenen, Haptenen, Enzymsubstraten, Enzym-Cofaktoren, Biotin, Carotinoiden, Hormonen, Neurohormonen, Neurotransmittern, Wachstumsfaktoren, Lympholocinen, Lectinen, Toxinen, Kohlenhydraten, Oligosacchariden, Polysacchariden, Dextranen, Nucleinsäuren, Oligonucleotiden, DNA, RNA, biologischen Zellen, Lipiden, rezeptorbindenden Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen Polymeren.

11. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche als Farbstoffe für die optische, insbesondere fluoreszenzoptische, Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), zur Erforschung des Genoms (DNA-Sequenzierung) und in Miniaturisierungstechnologien, beispielsweise in der Zytometrie und Zellsortierung, in der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), im Ultra-High-Throughput-Screening (UHTS), bei der Multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (DNA- und Protein-Chips).

12. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche als Farbstoffe zur Erkennung von Rezeptoren, wie Agonisten und Antagonisten für Zell-Membran-Rezeptoren, Toxine und andere Giftstoffe, virale Epitope, Hormone wie Opiate und Steroide, Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, als Kofaktoren agierende Wirkstoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Zellen, Zellfragmente, Gewebefragmente, Proteine und Antikörper.

13. Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen gemäß einem oder mehreren der vorgenannten Ansprüche als Farbstoffe zur Erkennung von Liganden, wie Agonisten und Antagonisten für Zell-Membran-Rezeptoren, Toxine und andere Giftstoffe, virale Epitope, Hormone wie Opiate und Steroide, Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, als Kofaktoren agierende Wirkstoffe, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine und Antikörper.

Description:

Die Erfindung betrifft die Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen als Löscher für fluoreszenzbasierende Nachweisreaktionen. Typische Verfahrensanwendungen beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen und Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies. Damit werden unter anderem Messungen von Enzymkinetiken, Rezeptor-Ligand-Interaktionen und Nukleinsäurehybridisierungskinetiken ermöglicht. Des Weiteren sind die beanspruchten Löscher für die pharmakologische Charakterisierung von Rezeptoren oder Wirkstoffen interessant.

Einsatzmöglichkeiten ergeben sich beispielsweise in der Medizin und Pharmazie, in der Bio- und Materialwissenschaft, bei der Umweltkontrolle sowie für den Nachweis von in Natur und Technik vorkommenden organischen und anorganischen Mikroproben.

Es sind bereits Farbstoffe als Löscher für Fluoreszenz bekannt. So wurde in der Arbeit von Jonathan P. May ein 1,4-Diaminoanthraquinonfarbstoff für die Anwendung in Molecular Beacons beschrieben (Chem. Comm., 2003, 970-971). Dieser Farbstoff ist aber auf Grund fehlender hydrophiler Funktionen (wie z. B. Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen) wasserunlöslich und daher nur schlecht zum Labeln von Biomolekülen einsetzbar. Darüber hinaus führt die sperrige Anthraquinonstruktur zur Farbstoffaggregation und damit zu instabilen spektralen Eigenschaften.

Mary K. Johannson beschreibt ebenfalls Farbstoffe (J. Am. Chem. Soc. 126, 2004, 16451), welche auf Grund fehlender hydrophiler Funktionen wasserunlöslich sind und durch ihre voluminöse Bisazostruktur zur Aggregation neigen. Darüber hinaus sind diese Farbstoffe über ihre Hydroxyethylfunktionen nur eingeschränkt an Biomoleküle immobilisierbar.

Dies gilt auch für die von Andrei Laikhter in der US 2005112673 A1 genannten Farbstoffe, welche schlecht wasserlöslich sind und über ihre Hydroxyethylfunktionen ebenfalls nur eingeschränkt an Biomoleküle immobilisiert werden können. Darüber hinaus weisen die Farbstoffe von Andrei Laikhter Nitrofunktionen auf, welche die Photostabilität drastisch verringern.

In WO 2000064988 A1 werden Xanthenfarbstoffe als Löschermoleküle beschrieben, Farbstoffe, welche eigentlich als hochfluoreszierend bekannt sind. Diese Farbstoffe haben den Nachteil, dass sie eine positive Ladung tragen und somit unspezifisch an negativ geladene Biomoleküle gebunden werden. Darüber hinaus sind diese eigentlichen Fluoreszenzfarbstoffe photochemisch instabiler als herkömmliche Absorptionsfarbstoffe.

Ferner sind langwellige Azofarbstoffe an sich bekannt, die beispielsweise zur Herstellung flüssigkristalliner Materialien diskutiert wurden (S. Yasui, M. Matsuoka, M. Takao, T. Kitao, The effect of annelation on the absorption spectra of polyazo dyes, J. Soc. Dyers Colour. 104 (1988) 284-288).

Des weiteren wurde die Verwendung von langwelligen Azofarbstoffen für die Herstellung von Materialien mit nichtlinearen optischen Eigenschaften vorgeschlagen (H. E. Katz, K. D. Singer, J. E. Sohn, C. W. Dirk, L. A. King, H. M. Gordon: Greatly enhanced secondorder nonlinear optical susceptibilities in donor-acceptor organic molecules, J. Am. Chem. Soc. 109, 1987, 6561-6563). Über Verwendungen als Löscher für fluoreszenzbasierende Nachweisreaktionen ist in der Fachwelt nichts bekannt geworden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, wasserlösliche Löscherfarbstoffe hoher Extinktion und guter Photostabilität zu schaffen, welche möglichst kovalent an Biomoleküle angebunden werden können und auf möglichst einfache Weise zuverlässige fluoreszenzbasierende Nachweisreaktionen ermöglichen.

Überraschend hat sich gezeigt, dass langwellige Azofarbstoffe der allgemeinen Formel I wobei:
R1-R5 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Chlor-, Brom- und/oder Iodatome, Alkyl-, Aryl-, Hereroaryl-, Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Alkyloxy-, Alkylmercapto-, Aryloxy-, Arylmercapto-, Heteroaryloxy-, Heteroarylmercapto-, Nitro-Reste, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Carbonsäureamid-, Trifluormethyl, Trifluoracetyl, Tricyanovinyl- oder Cyano-Reste, eine oder mehrere Hydroxy-, eine oder mehrere alkylsubstituierte oder cyclische Aminofunktionen sein können und R2 und R3 und/oder R4 und R5 weitere aliphatische oder aromatische Ringe bzw. zwei benachbarte Reste zusammen einen oder mehrere aliphatische oder aromatische Ringe bilden können, X ein Element aus der Gruppe O, S, Se, Te oder das Strukturelement (CR2)n mit n = 1 – 4, NR oder SO2 sein und für die Strukturelemente -CR2-O-, -O-CR2, -CO-O- oder -O-CO- stehen kann, R6 ein substituiertes aromatisches oder heteroaromatisches System ist, welches an die in (I) angegebene Grundstruktur gebunden ist, einer oder mehrere der Substituenten R1-R5 solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte Substituenten wie SO3-, PO32–, CO2, O, NR3+ oder Cyclodextrin oder Zucker darstellen, welche die hydrophilen Eigenschaften der Farbstoffe bestimmen, wobei diese Substituenten auch über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein können, mindestens einer der Substituenten R1-R5 für eine reaktive Gruppe vom Typ Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Amin, Mono- und Dichlor- bzw. Mono- und Dibromtriazin, Aziridin, Methacrylat, Acrylat, Vinyl, Vinylsulfonyl, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd bzw. Maleimid oder Iodacetamid sowie Phosphoramidit steht, wobei der jeweilige Substituent über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein kann und die aliphatische oder hereroaliphatische Spacergruppe aus einem Strukturelement -[(CH2)a-Y-(CH2)b]c besteht, worin Y gleich oder verschieden eine CR2-, O-, S-, SO2, SO2NH-, NR-, COO- oder CONR-Funktion sein kann, wobei R gleich oder unterschiedlich die Funktionen von R1-R5 einnehmen kann und a und b gleich oder verschieden die Werte von 0-18 und c die Werte von 1-18 darstellen.
hervorragend als wasserlösliche Löscher mit hoher Extinktion und stabilen spektralen Eigenschaften für fluoreszenzbasierende Nachweisreaktionen verwendet werden können. Die neuen Löscherfarbstoffe, deren Absorptionsmaxima üblicherweise größer als 560 nm liegen, weisen eine gute Photostabilität auf und können in der Regel kovalent an Biomoleküle angebunden werden. Durch diese zweckmäßige Anbindung der besagten Azofarbstoff-Derivate an die Biomoleküle entstehende Konjugate besitzen sehr gute lichtabsorbierende sowie lumineszenzlöschende Eigenschaften und können damit auf verfahrenstechnisch einfache Weise effiziente fluoreszenzbasierende Nachweisreaktionen ermöglichen. Die breiten Absorptionsbanden der Azofarbstoffe überlappen mit nahezu allen kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen.

Für spezielle Markierungen (z. B. der Markierung von negativ geladener DNA über elektrostatische Wechselwirkung mit positiv geladenen Farbstoffen, oder geladenen Proteinen mit ionischen Farbstoffen) kann es hingegen auch zweckmäßig sein, wenn die Markierung statt unter kovalenter Anbindung durch Ausbildung von ionischen Wechselwirkungen zwischen den Azofarbstoffen und den zu markierenden Materialien erfolgt. Auch bei solchen Verwendungen der langwelligen Azofarbstoffe sind die besagten Vorzüge für fluoreszenzbasierende Nachweisreaktionen gegeben.

Durch die Wahl geeigneter Substituenten R6 der allgemeinen Formel I (beispielsweise aromatischer oder heteroaromatischer Rest gemäß den Verbindungen II und III) können die spektralen Eigenschaften zusätzlich modifiziert werden, um die Löscherfarbstoffe an spezielle Fluoreszenzfarbstoffe anzupassen und noch effizientere Löschung zu erreichen.

Die Photostabilität der neuartigen Azofarbstoffe ist vielen bereits bekannten Farbstoffen wie z. B. Cyanin-, Hemicyanin-, Merocyanin- Oxonol und Stilbenfarbstoffen deutlich überlegen.

Die Azofarbstoffe sind durch einfache Syntheseschritte beispielsweise in wässrigem Medium ökonomisch leicht zugänglich. Sie können mittels in Biochemie und Biologie etablierter Methoden einfach und effizient an Biomoleküle gekoppelt werden. Durch spezielle Substitution der Reste R1-R5 in Verbindung I, R7-R12 in Verbindung II und R7-R15 in Verbindung III können sowohl kastionische, elektrisch neutrale sowie auch anionische Farbstoffe erhalten werden, um so unspezifische Wechselwirkungen mit Biomolekülen sowie Aggregation vermeiden zu können. Dabei kann der hydrophile Charakter der jeweils unterschiedlich absorbierenden Farbstoffe jedoch nahezu identisch gestaltet werden.

In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Verwendungen der langwelligen Azofarbstoffe nach allgemeiner Formel I angeführt. So kann als Rest R6 beispielsweise eine aromatische Verbindung der allgemeinen Formel II

Verwendung finden,
wobei:
R7-R12 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Chlor-, Brom- und/oder Iodatome, Alkyl-, Aryl-, Hereroaryl-, Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Alkyloxy-, Alkylmercapto-, Aryloxy-, Arylmercapto-, Heteroaryloxy-, Heteroarylmercapto-, Nitro-Reste, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Carbonsäureamid-, Trifluormethyl, Trifluoracetyl, Tricyanovinyl- oder Cyano-Reste, eine oder mehrere Hydroxy-, eine oder mehrere alkylsubstituierte oder cyclische Aminofunktionen sein können und R7 und R8 und/oder R11 und R12 weitere aliphatische oder aromatische Ringe bzw. zwei benachbarte Reste zusammen einen oder mehrere aliphatische oder aromatische Ringe bilden können, einer oder mehrere der Substituenten R7-R12 solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte Substituenten wie SO3, PO32–, CO2, O-, NR3+ oder Cyclodextrin oder Zucker darstellen, welche die hydrophilen Eigenschaften der Farbstoffe bestimmen, wobei diese Substituenten auch über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein können, mindestens einer der Substituenten R7-R12 für eine reaktive Gruppe vom Typ Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Amin, Mono- und Dichlor- bzw. Mono- und Dibromtriazin, Aziridin, Methacrylat, Acrylat, Vinyl, Vinylsulfonyl, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd bzw. Maleimid oder Iodacetamid sowie Phosphoramidit stehen kann, wobei der jeweilige Substituent über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein kann und die aliphatische oder hereroaliphatische Spacergruppe aus einem Strukturelement -[(CH2)a-Y-(CH2)b]c besteht, worin Y gleich oder verschieden eine CR2-, O-, S-, SO2, SO2NH-, NR-, COO- oder CONR- Funktion sein kann, wobei R gleich oder unterschiedlich die Funktionen von R1 bis R5 und R7 bis R12 einnehmen kann und a und b gleich oder verschieden die Werte von 0-18 und c die Werte von 1-18 darstellen.

Vorteilhaft wäre als Rest R6 auch eine aromatische Verbindung der allgemeinen Formel III wobei:
R7-R15 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Chlor-, Brom- und/oder Iodatome, Alkyl-, Aryl-, Hereroaryl-, Cycloalkyl-, Heterocycloalkyl-, Alkyloxy-, Alkylmercapto-, Aryloxy-, Arylmercapto-, Heteroaryloxy-, Heteroarylmercapto-, Nitro-Reste, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Carbonsäureamid-, Trifluormethyl, Trifluoracetyl, Tricyanovinyl- oder Cyano-Reste, eine oder mehrere Hydroxy-, eine oder mehrere alkylsubstituierte oder cyclische Aminofunktionen sein können und R7 und R8 und/oder R11 und R12 weitere aliphatische oder aromatische Ringe bzw. zwei benachbarte Reste zusammen einen oder mehrere aliphatische oder aromatische Ringe bilden können, einer oder mehrere der Substituenten R7-R15 solubilisierende bzw. ionisierbare bzw. ionisierte Substituenten wie SO3, PO32–, CO2, O-, NR3+ oder Cyclodextrin oder Zucker darstellen, welche die hydrophilen Eigenschaften der Farbstoffe bestimmen, wobei diese Substituenten auch über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein können, mindestens einer der Substituenten R7-R15 für eine reaktive Gruppe vom Typ Isocyanat, Isothiocyanat, Hydrazin, Amin, Mono- und Dichlor- bzw. Mono- und Dibromtriazin, Aziridin, Methacrylat, Acrylat, Vinyl, Vinylsulfonyl, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd bzw. Maleimid oder Iodacetamid sowie Phosphoramidit stehen kann, wobei der jeweilige Substituent über eine aliphatische oder heteroaliphatische, beispielsweise zyklische, Spacergruppe am Farbstoff angebunden sein kann und die aliphatische oder hereroaliphatische Spacergruppe aus einem Strukturelement -[(CH2)a-Y-(CH2)b]c besteht, worin Y gleich oder verschieden eine CR2-, O-, S-, SO2, SO2NH-, NR-, COO- oder CONR-Funktion sein kann, wobei R gleich oder unterschiedlich die Funktionen von R1 bis R5 und R7 bis R15 einnehmen kann und a und b gleich oder verschieden die Werte von 0-18 und c die Werte von 1-18 darstellen.

Nachstehend sollen beispielhaft vier spezielle Strukturen für langwellige Azofarbstoffe angegeben werden: