Title:
Reagent for reversible staining of proteins comprises a cationic detergent and a scandium chelate complex
Kind Code:
A1


Abstract:
Reagent for reversible staining of proteins comprises a cationic detergent and a scandium chelate complex, where the detergent is a trimethyl or benzyldimethyl alkylammonium halide in which the alkyl group has 6-30 carbon atoms, and the ligand of the complex is chromazurol S, eriochrome cyanine R or pyrocatechol violet.



Inventors:
Fricke, Beate, Dr. (Schraplau, 06279, DE)
Mixtacki, Heiko (Jahnsdorf, 09387, DE)
Application Number:
DE102005046093
Publication Date:
03/29/2007
Filing Date:
09/27/2005
Assignee:
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Halle, 06108, DE)
biostep Labor- und Systemtechnik GmbH (Jahnsdorf, 09387, DE)
International Classes:



Other References:
BULL. KOREAN CHEM, SOC. 1999, Vol. 20, No. 12,
S. 1409-1412;
Claims:
1. Mittel zur reversiblen Färbung von Proteinen, bestehend aus einem kationischen Detergens mit quartärem Stickstoffatom vom Trimethyl- oder Benzyldimethylammoniumalkylhalogenid-Typ mit Alkylketten unterschiedlicher Länge von C6 bis C30 und einem Metall-Chelat-Detergens-Komplex mit den Triarylmethan-Farbstoffen Chromazurol S, Eriochromcyanin R oder Pyrocatechol-Violett als organischen Liganden nach DE 10 2004 022 462 und Scandium als Metallion.

2. Mittel nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch Cetyltrimethylammoniumbromid als Detergens und dem Metall-Chelat-Komplex aus Scandium3+ und Chromazurol S.

Description:

Der Nachweis von Proteinen in SDS-Gelen erfolgt standardmäßig im sichtbaren Bereich mit der Coomassie-Blue-R-Färbung [1, 2] und mit verschiedenen Varianten der Silberfärbung [3-5]. Da diese Färbungen eine ausgeprägte Metachromie zeigen, sind sie stark von der Art der nachzuweisenden Proteine abhängig, d. h. die Vergleichbarkeit der Konzentration von verschiedenen Proteinen ist auf Grund ihrer unterschiedlichen Färbung eingeschränkt [6-8]. Diese Färbungen sind irreversibel und führen zur Derivatisierung bestimmter Aminosäurereste, wodurch eine nachfolgende Protein-Analytik durch N-terminales Sequencing und Massenspektrometrie in ihrer Aussage verfälscht wird und eine weitere Behandlung der im Gel getrennten Proteine wie Transfer auf Blots und anschließender Immunnachweis nicht möglich ist.

Von Rabilloud et al. wurde auf der Basis eines Ruthenium-Bathophenanthrolin-Komplexes eine Fluoreszenz-Färbemethode für Proteine in Gelen entwickelt [9], die aber eine wesentlich geringere Empfindlichkeit als SYPRO Ruby erreicht. SYPRO Ruby von Molecular Probes, Oregon, USA ist ein weiterer Metallchelat-Farbstoff, der für die Proteom-Forschung entwickelt wurde. Dieser Fluoreszenzfarbstoff ist in seiner Zusammensetzung nicht genau bekannt, es handelt sich um einen Metallchelat-Komplex aus Ruthenium (8. Nebengruppe) und einem unbekannten organischen Liganden [10]. Dieser Fluoreszenz-Farbstoff ist vermutlich in dem US-Patent [US 6,316,267] mit erfasst, in dem eine große Anzahl von neutralen oder anionischen Komplexen von Übergangsmetallen beansprucht wird. Er weist zwar eine hohe Empfindlichkeit und keine Metachromie auf, die Färbung ist aber schlecht reversibel, wodurch eine langwierige Behandlung der Gele vor der Proteinanalytik erforderlich wird. Als Fluoreszenzfarbstoff ist eine UV-Anregung mittels Transilluminatoren erforderlich, was ebenso wie der hohe Preis für diese Farblösung seine Akzeptanz im Laborbereich einschränkt.

Komplexe mit Liganden vom Triarylmethan-Typ (Chromazurol S, Eriochromcyanine R, Pyrocatecholviolett) wurden bisher vorwiegend zur spektrophotometrischen Bestimmung von Metallionen wie Aluminium und Beryllium in der Umweltanalytik eingesetzt [11-13], aber nicht zur Färbung von Proteinen. Gemäß DE 10 2004 022 462 wird ein Metall-Chelat-Detergens-Komplex, der aus Aluminiumionen, einem Triarylmethan-Farbstoff als organischem Liganden sowie einem kationischen Detergens mit quartärem Stickstoffatom vom Trimethyl- oder Benzyldimethyl-ammoniumalkylhalogenid-Typ mit Alkyl-Ketten unterschiedlicher Länge besteht, zum Nachweis im sichtbaren Bereich verwendet, z. B. in Elektrophoresegelen und auf Blots. Komplexe mit diesen Liganden fanden auch für den Nachweis der Nebengruppenmetalle Eisen, Scandium und Vanadium Verwendung. (14-16). Der in den Patentansprüchen angegebenen Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Proteine reversibel und ohne Derivatisierung bei gleichzeitiger Vergleichbarkeit der Proteinkonzentration durch Anfärben mit gemäß Hauptanmeldung gesteigerter Empfindlichkeit so nachzuweisen, dass eine nachfolgende Protein-Analytik nicht verfälscht wird.

Diese Aufgabe wird gemäß Patentansprüchen gelöst durch die Verwendung eines Metall-Chelat-Detergens-Komplexes zum Anfärben von Proteinen, der aus Scandiumionen, einem der Triarylmethan-Farbstoffe Chromazurol S, Eriochromcyanin R oder Pyrocatecholviolett als organischem Liganden sowie einem kationischen Detergens mit quartärem Stickstoffatom vom Trimethyl- oder Benzyldimethyl-ammoniumalkylhalogenid-Typ mit Alkyl-Ketten unterschiedlicher Länge C6 bis C30 besteht, beispielsweise der Komplex aus Scandium3+ und Chromazurol S mit Cetyltrimethylammoniumbromid, zum Nachweis im sichtbaren Bereich (Blaufärbung der Proteinbanden), der als AmphiOpt Visible bezeichnet wird, z. B. in Elektrophoresegelen und auf Blots.

Diese Färbemethode ist nicht metachrom, sondern ergibt eine spektral gleichartige Färbung mit allen Proteinen. Die Färbungen sind über weite Konzentrationsbereiche linear. Sie sind von höherer Empfindlichkeit als die Coomassie-Färbung und können durch Behandlung mit alkalischen Puffern und Chelatoren wie EDTA wieder entfernt werden. Nach Entfernen der Proteinfärbung auf SDS-Gelen können die Proteine mit guten Transferraten geblottet werden. Die Färbemethode ist prinzipiell auch als Blotfärbung für PVDF-Folien geeignet, die ebenfalls nach dem gleichen Prinzip vollkommen entfärbt werden und anschließend zum Westernblot oder zur Proteinanalytik (N-terminale Sequenzierung, Massenspektrometrie) eingesetzt werden können.

Die Metall-Chelat-Komplexe müssen für ihre Anwendbarkeit zur Proteinfärbung eine hohe Stabilitätskonstante aufweisen [17], so dass sie bei den erforderlichen Waschschritten nicht dissoziieren und müssen zudem eine intensive und spezifische Anfärbung der Proteine bewirken.

Die Bindung des Metall-Chelat-Detergens-Komplexes an die Proteine erfolgt im sauren pH-Bereich, vorzugsweise von 3 bis 6, in dem auch die Stabilität der Metall-Chelat-Komplexe am höchsten ist.

Die Zugabe von kationischem Detergens im submicellaren Konzentrationsbereich zum Farbstoff führt zu einer besseren Löslichkeit des Chelat-Komplexes und einer stärkeren Bindung des Metallchelat-Farbstoffes an die Proteine im Gel. Durch den Detergenszusatz zum Komplex wird die Farbe des Metall-Chelat-Komplexes in einen längerwelligen Bereich verschoben (1), wodurch ein besserer Kontrast mit dem Gelhintergrund bei der Dokumentation erreicht wird.

Die Färbung der Proteine erfolgt nach der Elektrophorese durch Entfernung des anionischen Detergens (SDS) und gleichzeitige Fixierung der Proteine mittels einer alkoholischen Lösung, anschließende Behandlung mit einem durch Mischen eines Scandiumhalogenids, vorzugsweise des Chlorids, mit einem der Triarylmethanfarbstoffe Chromazurol S, Eriochromcyanin R oder Pyrocatecholviolett im Metall-Liganden-Verhältnis 1 zu 1 entstandenen Metall-Chelat-Komplex in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mmol in einem sauren Puffer.

Die Entfernung der Hintergrundfärbung erfolgt mit einer im sauren Bereich gepufferten alkoholisch-wässrigen Lösung. Die Gele können anschließend eingescannt oder an einem Videosystem mit Weißlichtplatte aufgenommen werden. Von Vorteil bei dieser Färbemethode ist, dass keine Exposition auf einem Transilluminator erfolgen muss. Die Proteinbanden können direkt auf einer Leuchtplatte zur weiteren Analytik ausgeschnitten werden. Die Färbung ist empfindlicher als die Coomassie-Färbung, über ca. 12 Stunden in der der Waschlösung stabil und völlig reversibel. Ein zusätzlicher Vorteil im Vergleich zu DE 10 2004 022 462 ist die noch einmal um das Doppelte gesteigerte Empfindlichkeit, die mit diesem Farbstoff beim Nachweis von Proteinen in Gelen und auf Blots erreicht werden kann.

AnwendungsbeispielBeispiel 1: Sc3+-Chromazurol S-Komplex

Eichproteine werden in zunehmender Verdünnung (1:2, 1:4 usw.) auf 1 mm SDS-Polyacrylamid-Gele (10 % Acrylamid) aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Die Fixierung der Gele erfolgt für 30 bis 60 Minuten in einer 30 %-igen (v/v) Methanollösung. Anschließend werden die Gele mit Sc3+-Chromazurol S-Komplex, Konzentration 1 mmol, gelöst in Acetatpuffer pH 4,5, 0.05 M mit Zusatz von 0,2 nM CTAB und 20 % Methanol (AmphiOpt Visible) für 1 Stunde gefärbt. Der gefärbte Gelhintergrund wird durch einstündiges Waschen mit Acetatpuffer (pH 4,5, 50 mmol mit 20 % Methanol) reduziert. bis ein starker Kontrast der blauen Banden zur leichten Rosafärbung des Hintergrundes besteht. Dann erfolgt ein Übergang zu 20 % (v/v) Methanol als Entfärbemittel, um die Färbung der Banden zu stabilisieren und eine differentielle Entfärung des Gelhintergrundes zu erreichen (ca. 2 Stunden). Das Gel wird dann an einem Videosystem (Weißlichtplatte, UV-Röhren 312 nm, kein Vorfilter) bzw. auf einem Scanner dokumentiert.

Literatur

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