Title:
Leitende Kohlenstoff-Nanotubes, dotiert mit einem Metall, und Verfahren zur Herstellung eines Biosensors, der diese benutzt
Kind Code:
B4


Abstract:

Leitender CNT-Biosensor (Kohlenstoff-Nanotubes = CNT), in welchem Biorezeptoren, die an Zielbiomaterialien binden oder mit diesen reagieren, an das Metall (M) einer der Strukturen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
(a) leitenden CNTs, die eine Struktur CNT-(CONH-R1-S-M)r haben, in welcher M ein Metall repräsentiert, r eine natürliche Zahl größer als 1 ist und R1 C1-20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellt;
(b) einem leitenden CNT-Muster, das die Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q hat, in welcher p und q natürliche Zahlen größer als 1 sind, R2 und R3 C1-20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellen; und
(c) einem leitenden CNT-Film, der die Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q hat,
befestigt sind.




Inventors:
Lee, Sang Yup (Daejeon, KR)
Jung, Hee Tae (Daejeon, KR)
Jung, Dae Hwan (Daejeon, KR)
Ko, Young Koan (Daejeon, KR)
Kim, Do Hyun (Daejeon, KR)
Lee, Seok Jae (Daejeon, KR)
Kim, Byung Hun (Seoul/Soul, KR)
Lee, Jae Shin (Daejeon, KR)
Application Number:
DE102004027865
Publication Date:
09/13/2007
Filing Date:
06/08/2004
Assignee:
Korea Advanced Institute of Science & Technology (Daejeon, KR)



Foreign References:
200300127232003-01-16
63620112002-03-26
WO2003016901A12003-02-27
WO1999057564A11999-11-11
WO1995010481A11995-04-20
Other References:
Li, J. [u.a.]: Carbon Nanotube Nanoelectrode
Array for Ultrasensitive DNA Detection. Nano
Letters (2003), Vol. 3, No. 5, S. 597-602;
Cai, H. [u.a.]: Carbon nanotube-enhanced electro-
chemical DNA biosensor for DNA hybridization
detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry
(2003), Vol. 375, S.287-293,
Star, A. [u.a.]: Electronic Detection of Specific
Protein Binding Using Nanotube FET Devices. Nano
Letters (2003), Vol. 3, Nr. 4, S. 459-463;
Chen, R.J. [u.a.]: Noncovalent functionalization
of carbon nanotubes for highly specific electro-
nic biosensors. Proceedings of the National Aca-
demy of Science of the USA (2003), Vol. 100, Nr.
9, S. 4984-4989;
Attorney, Agent or Firm:
Patent- und Rechtsanwälte Kraus & Weisert (München, 80539)
Claims:
1. Leitender CNT-Biosensor (Kohlenstoff-Nanotubes = CNT), in welchem Biorezeptoren, die an Zielbiomaterialien binden oder mit diesen reagieren, an das Metall (M) einer der Strukturen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
(a) leitenden CNTs, die eine Struktur CNT-(CONH-R1-S-M)r haben, in welcher M ein Metall repräsentiert, r eine natürliche Zahl größer als 1 ist und R1 C1-20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellt;
(b) einem leitenden CNT-Muster, das die Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q hat, in welcher p und q natürliche Zahlen größer als 1 sind, R2 und R3 C1-20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellen; und
(c) einem leitenden CNT-Film, der die Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q hat,
befestigt sind.

2. Leitender CNT-Biosensor nach Anspruch 1, in welchem der Biorezeptor ein enzymatisches Substrat, ein Ligand, eine Aminosäure, ein Peptid, eine Nukleinsäure, ein Lipid, ein Cofaktor oder ein Kohlenhydrat ist.

3. Leitender CNT-Biosensor nach Anspruch 1, in welchem der Biorezeptor Thiolgruppen aufweist.

4. Leitender CNT-Biosensor nach Anspruch 1, in welchem das Metall Gold (Au) ist.

5. Leitender CNT-Biosensor nach Anspruch 1, in welchem eine Nukleinsäure an das Metall (M) von leitenden CNTs, die die Form CNT-(CONH-R1-S-M)r haben, angeheftet ist.

6. Leitender CNT-Biosensor nach Anspruch 1, in welchem das Metall Gold (Au) ist und die Nukleinsäure DNA ist.

7. Leitender CNT-Biosensor nach Anspruch 1, in welchem ein enzymatisches Substrat an das Metall (M) von leitenden CNTs, die die Form CNT-(CONH-R1-S-M)r aufweisen, befestigt ist.

8. Leitender CNT-Biosensor nach Anspruch 7, in welchem das enzymatische Substrat ein Kinase-Substratpeptid (Sp) ist.

9. Verwendung eines leitenden CNT-Biosensors nach Anspruch 8 zum Nachweis einer Kinase-beinhaltenden enzymatischen Reaktion.

10. Verfahren zur Herstellung eines leitenden CNT-Biosensors, welches die folgenden Schritte einschließt:
a) Bereitstellung von leitenden CNTs mit der Struktur CNT-(CONH-R1-S-M)r, umfassend die Stufen
(i) Bereitstellung von CNTs, welche eine Carboxylgruppe aufweisen;
(ii) Binden der Carboxylgruppe der CNTs an die Aminogruppen einer chemischen Substanz, welche eine Amino- und eine Thiolgruppe aufweist, um mit der Thiolgruppe modifizierte CNTs zu erhalten; und
(iii) Binden eines Metalls an die Thiolgruppen der Thiolgruppen-modifizierten CNTs,
worin M ein Metall bezeichnet, r eine natürliche Zahl größer als 1 ist und R1 C1-C20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellt, und
b) Anheften eines Biorezeptors, der an die Zielbiomaterialien über das Metall (M) von CNT-(CONH-R1-S-M)r bindet oder mit diesen reagiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, in welchem der Schritt (iii) durch Umsetzen der Thiolgruppen-modifizierten CNTs mit Metallnanopartikeln oder -kolloiden und der anschließenden Reduktion der resultierenden CNTs durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, in welchem die chemische Substanz, welche sowohl eine Amino- als auch eine Thiolgruppe aufweist, NH2-R1-SH ist; wobei R1 C1-20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellt.

13. Verfahren zur Herstellung eines leitenden CNT-Biosensors, welches folgende Schritte umfasst:
a) Bereitstellung eines leitenden CNT-Musters, das eine Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q hat, umfassend die Stufen:
(i) Bereitstellung eines Trägermaterials, welches auf seiner Oberfläche Thiolgruppen in Form eines Musters exponiert hat;
(ii) Binden des Metalls von leitenden CNTs, die mit einem Metall dotiert sind, worin die CNTs die Struktur CNT-(CONH-R1-S-M)r besitzen, an die Thiolgruppen auf der Trägermaterialoberfläche;
(iii) Binden leitender CNTs, die mit einem Metall dotiert sind, worin die CNTs die Struktur CNT-(CONH-R2-S-M)r besitzen, an die gebundenen leitenden CNTs, um die leitenden CNTs abzuscheiden; und
(iv) Wiederholung des Schrittes (iii),
worin p und q natürliche Zahlen größer als 1 sind und R2 und R3 C1-C20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellen, und
b) Anheften eines Biorezeptors, der an die Zielbiomaterialien über das Metall (M) von Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q bindet oder mit diesen reagiert.

14. Verfahren zur Herstellung eines leitenden CNT-Biosensors, welches folgende Schritte umfasst:
a) Bereitstellen eines leitenden CNT-Films, der eine Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q hat, umfassend die Stufen
(i) die Bereitstellung eines Trägermaterials, welches Thiolgruppen auf seiner Oberfläche exponiert hat;
(ii) Binden des Metalls der leitenden CNTs, die mit einem Metall dotiert sind, worin die CNTs die Struktur CNT-(CONH-R1-S-M)r besitzen, an die Thiolgruppen auf der Trägermaterialoberfläche,
(iii) Binden der leitenden CNTs, die mit einem Metall dotiert sind, worin die CNTs die Struktur CNT-(CONH-R1-S-M)r besitzen, an leitende CNTs, welche an dem Trägermaterial haften, um die leitenden CNTs abzuscheiden; und
(iv) Wiederholung des Schrittes (iii), um die Dichte der leitenden CNTs zu erhöhen,
worin p und q natürliche Zahlen größer als 1 sind, und R2 und R3 C1-C20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellen; und
b) Anheften eines Biorezeptors, der an die Zielbiomaterialien über das Metall (M) von Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q bindet oder mit diesen reagiert.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, in welchem der Schritt (i) die folgenden Schritte umfasst:
(i) Exponieren funktioneller Aminogruppen auf der Substratoberfläche, auf welcher CNTs abgeschieden werden sollen; und
(ii) Behandlung mit einer chemischen Substanz, die sowohl eine Carboxyl- als auch eine Thiolgruppe aufweist, um Amidbindungen zwischen der Aminogruppe auf dem Substrat und der Carboxylguppe der chemischen Substanz auszubilden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, in welchem die chemische Substanz, die sowohl eine Carboxyl- als auch eine Thiolgruppe aufweist, eine Substanz, dargestellt durch HOOC-R2-SH ist; wobei R2 C1-20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen bezeichnet.

17. Verfahren nach Anspruch 15, in welchem das Substrat, das funktionelle Aminogruppen auf seiner Oberfläche exponiert hat, durch die Behandlung eines bestimmten Substrats mit Aminoalkyloxysilan erhalten wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, in welchem der Schritt (iii) durch die Benutzung eines Linkers, der doppelte funktionelle Thiolgruppen hat, durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, in welchem der Linker, der doppelte funktionelle Thiolgruppen aufweist, HS-R3-SH ist; wobei R3 C1-20 gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, in welchem das Metall Gold (Au) ist.

21. Verfahren, um ein Zielbiomaterial zu detektieren, das an einen Biorezeptor bindet oder mit diesem reagiert, umfassend die Schritte:
a) Umsetzen des Zielbiomaterials mit einem CNT-Biosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6;
b) Detektion des Zielbiomaterials, das an den Biorezeptor bindet oder mit diesem reagiert.

22. Verfahren zur Herstellung eines Nukleinsäurechips, umfassend die Stufen:
a) Herstellen eines Substrats, bei dem Amin/Lysingruppen an der Oberfläche befestigt sind; und
b) Anheften des leitenden CNT-Biosensors nach Anspruch 5 an das in Stufe (a) hergestellte Substrat.

23. Verfahren nach Anspruch 22, in welchem die Stufe (b) durch die Anwendung einer Vernetzung mittels UV-Strahlung durchgeführt wird.

24. DNA-Chip, in welchem der leitende CNT-Biosensor nach Anspruch 6 an ein festes Trägermaterial, das Amin/Lysingruppen an seiner Oberfläche befestigt hat, befestigt ist.

25. Verwendung eines DNA-Chips nach Anspruch 24 zum Nachweis von DNA-Hybridisierung.

Description:
HINTERGRUND DER ERFINDUNGGebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf leitende Kohlenstoff-Nanotubes (CNTs), die durch das Dotieren von carboxylierten Kohlenstoff-Nanotubes mit Metallnanokristallen über funktionelle chemische Gruppen erhalten werden. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf einen Biosensor, in dem Biorezeptoren, die an Ziel-Biomoleküle binden, selektiv an den leitenden CNTs oder einem leitenden CNT-Muster oder -Film befestigt sind, sowie auf ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Stand der Technik

Ein Kohlenstoff-Nanotube (CNT) ist eine allotrope Form von Kohlenstoff, welche aus Kohlenstoffen, die reichlich auf der Erde vorkommen, besteht. Diese sind röhrenförmige Stoffe, in welchen ein Kohlenstoffatom an andere Kohlenstoffe in der Form einer hexagonalen Bienenwabenstruktur gebunden ist. Ihr Durchmesser liegt ungefähr in der Größe eines Nanometers (1/109 Meter). Ein CNT ist dafür bekannt, exzellente mechanische Eigenschaften, elektrische Selektivität, Feldemissionseigenschaften und hocheffiziente Wasserstoffspeichereigenschaften zu haben, und neu und so gut wie fehlerfrei in Bezug auf alle existierenden Stoffe zu sein.

Deshalb zeigt ein solcher CNT unbegrenzte Anwendbarkeit auf den Gebieten von Elektronenemissionsquellen, fluoreszierenden Vakuumdisplays (VFD), weißen Leuchtquellen, Feldemissionsdisplays (FED), sekundären Lithiumionen-Batterieelektroden, Wasserstoffspeicher-Brennstoffzellen, Nano-Drähten, Nano-Kapseln, Nano-Pinzetten, AFM/STM-Spitzen, Einzelelektronengeräten, Gassensoren, mikroskopischen Teilen der Medizintechnik etc.

Aufgrund seiner Eigenschaften von ausgezeichneter Struktursteifigkeit, chemischer Stabilität, dem Vermögen, als ideale eindimensionale (1D) "Quantendrähte" mit entweder halbleitendem oder metallischem Verhalten und einem großen Seitenverhältnis zu fungieren, weist ein CNT eine ausgedehnte Reihe potentieller Einsatzmöglichkeiten als Grundstoff von flat panel displays, Transistoren, Energiespeichern etc. und als verschiedene Sensoren im Nanogrößenbereich auf (Dai, H., Acc. Chem. Res., 35:1035, 2002).

Um solche Eigenschaften verschiedenartiger anzuwenden, wurde der gereinigte einzelwändige CNT unter Verwendung von Säure in kurze Nanotube-Stücke geschnitten. Die geschnittenen CNT-Stücke weisen vorwiegend -COOH-funktionelle chemische Gruppen an einem Teil der Enden und Seitenwände der offenen Röhre auf. Die Eigenschaften des CNT wurden durch das chemische Binden von verschiedenen Stoffen unter Verwendung dieser funktionellen chemischen Gruppen modifiziert. Des Weiteren wurde berichtet, dass die funktionelle Gruppe von CNT durch eine -SH-Gruppe durch chemische Manipulation ersetzt wurde und musterförmig auf eine Goldoberfläche mit Hilfe des Mikrokontakt-Druckverfahrens bzw. microcontact printing method aufgebracht wurde (Nan, X., et al., J. Colloid Interface Sci., 245:311, 2002) und dass das CNT auf einem Trägermaterial in Form eines vielschichtigen Films mit Hilfe des elektrostatischen Verfahrens bzw. electrostatic method immobililsiert wurde (Rouse, J.H. et al., Nano Lett., 3:59, 2003). Allerdings hat Erstgenanntes die Nachteile der niedrigen CNT-Oberflächendichte und einer schwachen Bindung und Letztgenanntes hat außerdem den entscheidenden Nachteil, dass das Mustererstellungsverfahren für selektive Immobilisierung auf der Oberfläche nicht angewendet werden kann. Deshalb gibt es einen dringenden Bedarf zur Entwicklung einer neuen Art eines Oberflächenimmobilisierungsverfahrens mit hoher Dichte.

Desweiteren beschreibt die WO 95/10481 eine Zusammensetzung, umfassend ein Kohlenstoff-Nanotube und/oder ein „nested" Fulleren mit Übergangsmetallpartikeln, -clustern und/oder -schichten darauf, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung, wobei das Metall bevorzugt aus der Gruppe Cr, Mo, W, Mn, Re, Fe, Ru, Os, Co, Rh, Ir, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag und Au ist. Ferner beschreibt die WO 99/57564 ein Verfahren zum Immobilisieren und/oder Kristallisieren von Macromolekülen, chemische Reagenzien, die in dem Verfahren verwendet werden, resultierende Produkte und die Verwendung dieser Produkte im Gebiet der Materialien und Strukturbiologie, insbesondere als Biosensoren oder als Biomaterialien. Das Verfahren besteht im Wesentlichen darin, ein biologisches Makromolekül in Lösung mit an ihren Enden geschlossenen Kohlenstoff-Nanotubes ohne Rühren für wenigstens 15 Minuten bei geeigneten Temperatur- und pH-Bedingungen zu inkubieren. Weiterhin beschreibt die US 2003/0012723 A1 Verfahren zum Anordnen einwandiger Kohlenstoff-Nanotube-Strukturen in ausgewählten Orientierungen für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen, wobei die Verfahren erreicht werden, indem zunächst die Nanotube-Strukturen in wässrigen Lösungen unter Verwendung eines geeigneten Dispergiermittels dispergiert werden. Das Dispergiermittel beschichtet jede einzelne Nanotubestruktur in der Lösung. Das Dispergiermittel kann mit einer geeigneten funktionellen Gruppe, die mit einer entsprechenden Bindungsstelle reagiert, substituiert sein. Die mit den substituierten Dispergiermitteln beschichteten Nanotube-Strukturen werden gegenüber einer ausgewählten Anordnung von Bindungsstellen exponiert, sodass sich die Nanotubes aufgrund der Bindung der substituierten funktionellen Gruppen mit derartigen Bindungsstellen entsprechend der Bindungsstellen ausrichten. Alternativ wird das kristalline Nanotube-Material gebildet bei Abscheidung von dispergierten Nanotube-Strukturen in Lösung in Kanäle, die auf der Oberfläche des Substrats angeordnet sind. Eine Kombination der Techniken mit chemischer Modifikation des Dispergiermittels mit der Abscheidung der Nanotubes in Substratkanäle kann ebenfalls eingesetzt werden, um derartige Strukturen zu produzieren.

Da die meisten Krankheiten auf der Proteinebene und nicht auf der genetischen Ebene verursacht sind, zielen mehr als 95% der medizinischen Arzneimittel, die bis jetzt entwickelt worden sind oder gegenwärtig entwickelt werden, auf ein Protein ab. Folglich sind Technologien zur Detektion von Protein-Protein- und Protein-Ligand-Wechselwirkungen notwendig in Studien zum Nachweis der Funktion von Biomolekülen, die mit gewissen Proteinen und Liganden wechselwirken, und zur Entwicklung therapeutischer und vorbeugender Verfahren gegen Krankheiten, die unmöglich mittels klassischer Techniken entwickelt werden konnten, die auf von Protein-Funktionsanalyse und Netzwerkanalyse erhaltenen Daten basieren.

Die Technologie für die Detektion von Pratein-Protein-Wechselwirkungen, die bis jetzt durchgeführt worden ist, ist eine Protein-Chip-Technologie. Diese kann als eine Technologie angesehen werden, in der die Orientierung von Biomolekülen auf einer molekularen Ebene mit Hilfe einer Affinitätsmarkierung für ein Zielprotein kontrolliert wird, um spezifisch eine gleichmäßige stabile Einzelschicht des Proteins auf der Oberfläche eines Trägermaterials zu immobilisieren, gefolgt von der Analyse der Protein-Protein-Wechselwirkung (Hergenrother, P.J. et al., JACS, 122: 7849, 2000; Vijayendran, R. J., A. et al., Anal. Chem., 73:471, 2001, Benjamin, T. et al., Tibtech., 20:279, 2002).

Seit kurzer Zeit werden Forschungen durchgeführt, um Reaktionen zwischen sowohl Protein-Protein als auch Protein-Ligand mittels elektrochemischer Änderungen von CNT nach Immobilisierung eines Biomaterials zu detektieren (Dai, H. et al., ACC. Chem. Res., 35:1035, 2002; Sotiropoulou, S. et al., Anal. Bioanal. Chem., 375:103, 2003; Erlanger, B.F. et al., Nano Lett., 1:465,2001; Azamian, B.R. et al., JACS; 124:12664, 2002). Ein repräsentatives Beispiel einer Protein-Liganden-Reaktion ist eine Avidin-Biotin-Reaktion. Star et al. bildeten einen Kanal auf einem Trägermaterial, welches mit einem Polymer behandelt worden war, unter Benutzung von CNT, und maßen die Bindungsaktivität von Streptoavidin mittels einer elektrochemischen Methode (Star, A. et al., Nano Lett., 3:459, 2003). Darüberhinaus beschreibt die US 6,362,001 B1 graphitische Nanotubes, die röhrenförmige Fullerene (im Allgemeinen als „buckytubes" bezeichnet) und Fibrillen umfassen, die mittels chemischer Substitution funktionalisiert sind und als feste Träger in Elektrochemilumineszenzassays verwendet werden. Vor der Verwendung in einem Assay werden die graphitischen Nanotubes über funktionelle Gruppen mit Biomolekülen chemisch modifiziert. Die Assoziation elektrochemilumineszierender Rutheniumkomplexe mit den über funktionelle Gruppen mit Biomolekülen modifizierten Nanotubes erlaubt die Detektion von Molekülen, einschließlich Nukleinsäuren, Antigenen, Enzymen und Enzymsubstraten, durch unterschiedliche Formate. Die Biomoleküle können unter anderem über eine Substanz gebunden werden, die eine Amino- und eine Thiolgruppe aufweist.

Die Verfahren, umfassend die Herstellung einer CNT-Multilayer mit hoher Dichte, das Befestigen von DNA darauf und die Detektion komplementärer DNA, sind nützlich beim Genotyping, bei der Mutationsdetektion, Pathogenidentifikation und dergleichen. Es wurde berichtet, dass PNA (Peptidnukleinsäure: DNA-Imitator bzw. "mimic") regiospezifisch auf einem einzelwändigen CNT befestigt ist und die komplementäre Bindung an Sonden-DNA detektiert wird (Williams, K.A. et al., Nature, 420:761, 2001). Außerdem hat es ein Beispiel gegeben, in welchem ein Oligonukleotid auf einem CNT-Array über eine elektrochemische Methode befestigt wurde und DNA über Guanidinoxidation detektiert wurde (Li, J. et al., Nano Lett., 3:597, 2003). Jedoch ist es nicht so, dass diese Methoden CNT zur Herstellung und Entwicklung von Biochips anwenden.

Vor kurzem wurde ein Biomolekül-Detektionssensor mit hoher Kapazität, der CNT verwendet, offenbart (WO 03/016901 A1). Dieses Patent betrifft einen Biochip vom Mehrkanal-Typ, der durch die Anordnung einer Vielzahl von CNTs auf einem Trägermaterial unter Verwendung eines chemischen Linkers und der Befestigung verschiedener Arten von Rezeptoren produziert wird. Allerdings hat es einen Nachteil, dass er aufgrund der relativen Schwäche der elektrischen Leitfähigkeit nicht präzise analysieren kann.

Die Gründe, warum CNT als ein Biochip öffentliche Aufmerksamkeit erregt, sind wie folgt: Erstens, es bedarf keiner Markierung; zweitens, es hat eine hohe Sensitivität gegenüber einer Signaländerung; und drittens, es ist fähig zur Reaktion in einer wässrigen Lösung ohne ein Protein zu schädigen. Die Kombination eines neuen Nanomaterials und eines biologischen Systems wird wichtige Fusionstechnologien in den entsprechenden Gebieten der Krankheitsdiagnose (Erbkrankheiten), Proteomics und Nanobiotechnologie schaffen.

Eine große Menge genetischer Information wurde über das Projekt zur Totalsequenzierung des menschlichen Genoms bzw. "human genome project" erhalten und diese Information stellte einen Trittstein bereit, der zur Innovation in dem Verständnis und der Diagnose genetischer Krankheiten führen wird. In dieser Strömung ist die Entwicklung eines effektiven DNA-Fingerprinting-Systems zur Genomsequenzierung, Mutationsdetektion und Pathogenidentifizierung erforderlich.

Um einen schnelleren und billigeren Biosensor zu entwickeln, sind viele Forschungen über Technologien der DNA-Hybridisierungsdetektion durchgeführt worden. Verschiedene Markierungstechniken zur Detektion von DNA-Hybridisierung wurden entwickelt und gegenwärtig werden fluoreszierende Substanzen am allermeisten beim Markieren eingesetzt. Eine DNA-Einzelkette, fähig zur Detektion komplementärer DNAs, wird immobilisiert, um komplementäre DNAs in einer wässrigen Lösung zu erkennen, und ein Signalwandler ändert ein DNA-Hybridisierungssignal in ein analysierbares Signal.

Was die Signalwandler betrifft, werden optische (fluoreszierende), piezoelektrische und elektrochemische Transduktionstechniken untersucht. Unter ihnen hat die elektrochemische Technik verschiedene Vorteile einschließlich einer hohen Sensitivität, niedriger Kosten und einer Kompatibilität mit Mikroherstellungstechnologie ("microfabrication technology") und sie kann DNA mit einer bestimmten Basensequenz auf eine schnelle und direkte Art und Weise detektieren.

Es gibt verschiedene Verfahren, die dazu fähig sind, eine DNA-Sonde auf einer Wandleroberfläche (CNTs der vorliegenden Erfindung) zu immobilisieren, und diese können in verschiedene Kategorien eingeordnet werden, welche chemische Adsorption, covalente Bindung, elektrostatische Anziehung, Copolymerisierung und Avidin-Biotin-Affinitätssystem einschließen. Außerdem können die DNAs auf einer Oberfläche im Mikrometermaßstab unter Verwendung eines leitenden Polymers immobilisiert werden.

Eine effektive Oberflächenbehandlung, fähig zur Verstärkung der Hybridisierungseffizienz und dem gleichzeitigen Entfernen des Hintergrunds von nicht-spezifischer Bindung, ist erforderlich, um DNA-Hybridisierung effektiv mit Hilfe von einem DNA-Chip zu detektieren. Viele Forschungen sind durchgeführt worden, um eine Oberflächenbehandelte DNA-Chip-Plattform herzustellen (Rogers, Y. et al., Anal. Biochem., 266:23, 1999; Hu, J. et al., Nuc. Acid. Res., 29:106, 2001). Außerdem wurden verschiedene Verfahren zur Detektion von DNA-Hybridisierung entwickelt, welche das scanometrische Verfahren (scanometric method), das kolorimetrische Verfahren, ein Verfahren, das Nanopartikel verwendet, ein Verfahren, das Elektrochemie verwendet, und etc. einschließen (Taton, T.A. et al., Science, 289:1757, 2000; Alexandre, I. et al., Anal. Biochem., 295: 1, 2001; Cai, H. et al., Analyst., 127:803, 2002; Cai, H. et al., Anal. Bioanal. Chem. 375:287, 2003).

Ferner sind kürzlich viele Anwendungen mit CNT auf dem Gebiet des Bioengineering in Erscheinung getreten. Vorgeschlagen werden eine Anwendbarkeit von CNT für Biochips, wie z.B. Glucose-Biosensoren, die Proteindetektion und die Detektion einer bestimmten DNA-Sequenz und dergleichen (Sotiropoulou, S. et al., Anal. Bioanal. Chem., 375:103, 2003; Chen, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:4984, 2003; Cai, H. et al., Anal. Bioanal. Chem., 375: 287, 2003). Das Durchmustern von Biomolekülen von einer Mehrfachschicht, basierend auf CNT, kann die Menge von immobilisierten Biosubstanzen, wie z.B. DNAs, und die Nachweissensitivität der Biosubstanzen vergrößern, nachdem die Mehrfachschicht, basierend auf CNT, eine weite Oberfläche und hohe elektrische Leitfähigkeit aufweist.

Die unlängst entstandene Tendenz, die Biotechnologie (BT) mit Nanotechnologie (NT) zu kombinieren, hat die Entwicklung von Hybrid-Nanomaterialien, die die Eigenschaft von Biomaterialien, die spezifisch binden können, ausnutzen, beschleunigt. DNAs werden hervorgehoben als intelligente Nanodrähte, die an die gewünschten Stellen (Stellen, an welche in der vorliegenden Erfindung Gold-Nanokristalle gebunden werden) binden können.

Die Kombination von Informationstechnologie (IT), NT und BT hat es ermöglicht, schnelle und präzise digitale Information bei der Messung von analogen Daten, wie z.B. der Anwesenheit oder Abwesenheit von Biomaterialien, und Reaktivität zu gebrauchen. Dies nennt man eine elektrische Detektionsmethode (Chen, J. et al., JACS, 122:657, 2000; Dahne, L. et al., JACS, 123:5431, 2001).

Eine Lipid-Protein-Doppelschicht, welche zuerst untersucht worden war, hat elektrische Eigenschaften. Deshalb wurde sie bei Zellimmobilisierung benutzt, um Zelloberflächen-Charakteristika und alle Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Eine etwas praktischere Anwendung war es, eine, Rezeptorschicht als einen Biosensor für optische und elektrische Detektion zu benutzen. Im Jahre 1993 beschrieb der Deutsche Stelzle, M. et al. deren Fähigkeit als ein Biosensor über Impedanzanalyse in einem Sensor, basierend auf zwei Schichten von Lipid/Rezeptor (Stelze, M. et al., J. Phys. Chem., 97:2974, 1993). Weiterhin wurde auf dem Fachgebiet der Detektion kleinerer Moleküle über elektrische Verfahren über das Ergebnis einer Studie berichtet, die anzeigt, dass die Richtungen elektrischer Dipole in organischen Molekülen im Nanomaßstab durch die Anwendung elektrischer Pulse bei einer Sonde, wie z.B. AFM, kontrolliert werden kann. Gemäß dieser Studie können molekulare Speicherchips mit hoher Dichte, wie z.B. Geräte, hergestellt werden und die elektrische Ladung der organischen Moleküle kann auch nach diesem Prinzip gemessen werden, wenn die Sonde mit einem geeigneten Metall überzogen ist, um elektrische Eigenschaften zu haben und elektrische Pulse mit gewechselter Polarität an die organischen Moleküle von der Sonde angewendet werden (Matsushige, K. et al., Nanotechnol., 9:208, 1998).

Des Weiteren wurde kürzlich eine Erfindung eingereicht (WO 2002/86168 A1), die sich auf Verfahren zum Vergleich der relativen Gehalte von Biomolekülen und der Identifizierung von Biomolekülen in einer Probe mittels Affinitätsmarkierungen und Massenspektrometrie bezieht.

Zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist das allgemeinste Verfahren zum Nachweis des Ergebnisses der Reaktion in einem Biochip, konventionelle fluoreszierende Materialien und Isotope zu verwenden (Toriba, A. et al., Biomed. Chromatogr., 17:126, 2003; Syrzycka, M. et al., Anal. Chim. Acta, 989:1, 2003; Grow, A.E. et al., J. Microbio. Meth., 53:221, 2003). Jedoch, da neue Verfahren, um einfach und präzise ein elektrisches oder elektrochemisches Signal zu messen, versucht werden, gibt es verstärkte Forderungen nach CNT als einem neuen Material.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen leitenden CNT-Biosensor, wo eine Reihe von Biorezeptoren an die leitenden CNTs, das leitende CNT-Muster oder den leitenden CNT-Film befestigt werden, bereitzustellen, genauso wie ein Herstellungsverfahren davon.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Detektion verschiedener Ziel-Biomaterialien, die an verschiedene Biorezeptoren binden oder an diesen reagieren, bereitzustellen, das den CNT-Biosensor verwendet.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist ein schematisches Diagramm, das ein Verfahren zur Herstellung von Kohlenstoff-Nanotubes (CNTs), dotiert mit Goldnanopartikeln, zeigt.

2 ist ein schematisches Diagramm, das ein Verfahren zur Anfertigung eines polymeren Maskenmusters mit einer gegebenen Form zur Integration von CNTs von 1 auf einem Silicium-Trägermaterial mit Photolithographie zeigt.

3 ist ein Flussdiagramm, das ein Verfahren zur Herstellung eines Musters von CNTs, dotiert mit Goldnanopartikeln, zeigt. 3a ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, dass eine Thiol-(-SH)-Gruppe auf der Oberfläche eines Trägermaterials exponiert ist und darauf ein Muster gebildet hat, und eine CNT-Einzelschicht, dotiert mit Goldnanokristallen, auf der Oberfläche des Trägermaterials immobilisiert wird. 3b ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, wie andere CNTs, dotiert mit Goldnanokristallen, auf der CNT-Einzelschicht von 3a über eine chemische Substanz, die zwei Thiolgruppen aufweist, immobilisiert werden. 3c ist ein schematisches Diagramm, das ein Verfahren zur Erhöhung der Oberflächendichte von CNTs, dotiert mit Goldnanopartikeln, durch das Wiederholen des Verfahrens von 3b zeigt. 3d ist ein schematisches Diagramm, das ein Verfahren zur Abscheidung von CNTs, dotiert mit Goldnanopartikeln, um von hoher Dichte zu sein, durch das Wiederholen des Verfahrens von 3c zeigt. 3e ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, dass CNTs, dotiert mit Goldnanopartikeln, auf dem Trägermaterial abgeschieden sind, um von hoher Dichte zu sein, um ein CNT-Muster zu bilden.

4 ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, dass verschiedene Rezeptoren, die funktionelle Gruppen aufweisen, welche an die Goldnanopartikel von mit Goldnanopartikeln dotierten CNTs binden oder mit diesen reagieren, befestigt werden und dann selektiv mit verschiedenen Ziel-Biomaterialien interagierten. Bezugszeichen 1 und 2 kennzeichnen Biorezeptoren, fähig zur Interaktion mit Ziel-Biomaterialien, Bezugszeichen 4 kennzeichnet Ziel-Biomaterialien, fähig zur Reaktion mit den Biorezeptoren, und Bezugszeichen 3 kennzeichnet Oligonukleotide unter den Biorezeptoren. Bezugszeichen 5 kennzeichnet komplementäre Nukleinsäuren, fähig zur Hybridisierung mit den Oligonukleotiden, immobilisiert auf dem Metall von leitenden CNTs, und 6 kennzeichnet allgemeine Biomaterialien, die keine Reaktivität aufweisen.

5 zeigt einen CNT-Au-Substratpeptidkomplex, in dem ein Kinasesubstratpeptid, das eine funktionelle Thiolgruppe aufweist, auf CNTs, dotiert mit Goldnanopartikeln, immobilisiert ist, zur Kinaseenzymreaktion.

6 ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, dass Ionen, produziert von der Kinaseenzymreaktion, unter Verwendung eines Substratpeptids, immobilisiert auf CNTs, durch die Induktion einer Oxidations-Reduktions-Reaktion gemessen werden.

7 ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, dass die Konzentration von Ionen, produziert durch die Kinaseenzymreaktion, unter Verwendung eines Substratpeptids, immobilisiert auf CNTs, unter Verwendung eines Kondensators gemessen wird.

8 ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, dass die Konzentration von Ionen, produziert durch die Kinaseenzymreaktion, unter Verwendung eines Substratpeptids, immobilisiert auf CNTs, durch die Verwendung einer geladenen Platte, die in einen polymeren Chip eingefügt ist, gemessen wird.

9a ist eine TEM-Photographie, die ein Goldkristall-dotiertes CNT zeigt, das durch die Bildung von Thiol(-SH)-Gruppen auf einem CNT und die Reaktion der Thiolgruppen mit Goldkolloiden erhalten wurde, und 9b ist eine TEM-Photographie, die ein CNT, erhalten durch die Reaktion von Goldkolloiden mit einem CNT, das keine Thiol(-SH)-Gruppen aufweist, zeigt.

10 ist eine HR-TEM-Photographie von 9, die auf eine hohe Vergrößerung vergrößert wurde.

11 ist ein XPS-Doublett-Spektrum für Goldkristalle, dotiert auf CNTs.

12 ist ein schematisches Diagramm, das zeigt dass DNA an ein CNT, dotiert mit Goldnanopartikeln, bindet, um einen CNT-Au-DNA-Komplex, auszubilden. 12a zeigt, dass DNA spezifisch an Goldnanopartikel, dotiert auf der Wandoberfläche eines CNTs gebunden ist, und 12b zeigt, dass ein CNT-Au-DNA-Komplex an die Oberfläche eines Trägermaterials gebunden ist.

13 ist eine Photographie, die zeigt, dass DNAs, die funktionelle Thiolgruppen aufweisen, an CNTs, dotiert mit Goldnanopartikeln, befestigt sind. 13a ist eine Photographie, die den Vergleich der Ergebnisse der Wechselwirkungen zwischen verschiedenen DNAs und CNTs zeigt, und 13b ist eine Photographie, die die Ergebnisse des Vergleichs zeigt, um zu bestimmen, ob DNA komplementär an ein CNT-Muster bindet.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND DEREN BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORM

Um die obigen Aufgaben zu lösen, stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt einen leitenden CNT-Biosensor bereit, in welchem ein Biorezeptor, der an Ziel-Biomaterialien bindet oder mit diesen reagiert, an eines, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Folgenden, befestigt ist: (a) leitende CNTs, die eine Struktur von CNT-(CONH-R1-S-M)r haben, wobei M ein Metall darstellt, R eine natürliche Zahl größer als 1 ist und R1 C1-20-gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellt; (b) ein leitendes CNT-Muster, das eine Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q aufweist, wobei p und q natürliche Zahlen größer als 1 sind, R2 und R3 C1-20-gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellen; und (c) ein leitender CNT-Film, der eine Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-S-M-CNT-M-(S-R3-S-M-CNT-M)p]q aufweist. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des leitenden CNT-Biosensors bereit.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Ziel-Biomaterialien, die an Biorezeptoren binden oder mit diesen reagieren, bereit, wobei das Verfahren dadurch charakterisiert ist, dass es den leitenden CNT-Biosensor verwendet.

In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen leitenden CNT-Biosensor in Form eines leitenden CNT-M-Nukleinsäurekomplexes bereit, wobei eine Nukleinsäure an das Metall M von leitenden CNTs, die eine Form von CNT-(CONH-R1-S-M)r aufweisen, befestigt ist, genauso wie ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäurechips, welches das Befestigen der Nukleinsäurekomplexe an einem Trägermaterial, welches Amin/Lysingruppen auf seiner Oberfläche befestigt hat, umfasst. In diesem erfinderischen Verfahren wird das Befestigen der CNT-M-Nukleinsäurekomplexe auf dem Trägermaterial vorzugsweise durch die Verwendung einer Vernetzung mittels UV-Bestrahlung durchgeführt und die Nukleinsäure ist vorzugsweise DNA.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung DNA-Chips bereit, bei welchen leitende CNT-Au-DNA-Komplexe an einem festen Trägermaterial befestigt sind, ebenso wie ein Verfahren zur Detektion von DNA-Hybridisierungsreaktionen, welches dadurch charakterisiert ist, dass es diese DNA-Chips verwendet.

In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung leitende CNT-Biosensoren in Form von CNT-M-Enzymsubstratkomplexen bereit, wobei ein Enzymsubstrat an das Metall (M) von leitenden CNTs, die eine Form von CNT-(CONH-R1-s-M)r haben, befestigt ist. In den Komplexen ist das Enzymsubstrat vorzugsweise ein Kinasesubstratpeptid (SP).

In einem anderen weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Kinaseinvolvierenden enzymatischen Reaktionen bereit, welches dadurch charakterisiert ist, dass es die leitenden CNT-M-Sp-Komplexe verwendet. In diesem erfinderischen Verfahren wird die Detektion der enzymatischen Reaktionen vorzugsweise durch die Verwendung eines elektrischen Signals durchgeführt.

Die Ziel-Biomaterialien, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, sind Substanzen, die dazu fähig sind, als Ziele, die durch Reaktion mit oder das Binden von Biorezeptoren detektiert werden, zu fungieren, und sie sind vorzugsweise Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, Enzyme, Kohlenhydrate, Lipide oder andere Biomoleküle, die aus einem lebenden Körper abgeleitet sind, und am bevorzugtesten Krankheits-bezogene Proteine.

Die Biorezeptoren, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, sind vorzugsweise Enzymsubstrate, Liganden, Aminosäuren, Peptide, Nukleinsäuren, Lipide, Cofaktoren oder Kohlenhydrate und außerdem besitzen sie vorzugsweise Thiolgruppen.

Obwohl das Metall wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, vorzugsweise Gold (Au) ist, können Silber(Ag)-Nanopartikel, Platin(Pt)-Nanopartikel, Eisen(Fe)-Nanopartikel, Nickel(Ni)-Nanopartikel oder Kobalt(Co)-Nanopartikel auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Wie hierin verwendet, ist der Ausdruck "leitender CNT-Biosensor" so definiert, dass er Biosensoren einschließt, wo Rezeptoren, die mit Biomaterialien reagieren, an leitenden CNTs befestigt sind, und diese Definition schließt Biochips mit ein, die an leitenden CNTs befestigt sind. Ferner bedeutet der Ausdruck "dotieren", dass das Metall an die CNTs in der Form von Dots bindet, und der Ausdruck "Enzymsubstrat" ist ein allgemeiner Name für Reaktionsmaterialien, die in enzymatische Reaktionen involviert sind. Um in der vorliegenden Erfindung die elektrischen Eigenschaften der existierenden CNTs zu verbessern, werden die CNTs mit Metall-Nanopartikeln dotiert. Die CNTs, dotiert mit den Metall-Nanopartikeln, werden wiederholtermaßen auf einem festen Trägermaterial, das mit funktionellen chemischen Gruppen überzogen ist, über chemisches Binden abgeschieden, um ein leitendes CNT-Muster (oder einen CNT-Film) mit hoher Oberflächendichte herzustellen. Ferner werden verschiedene Biorezeptoren, die funktionelle Gruppen haben, die mit den Goldnanokristallen, welche in dem CNT-Muster mit hoher Dichte vorhanden sind, reagieren, an dem CNT-Muster oder dem CNT-Film befestigt um einen Biosensor herzustellen, der verschiedene Ziel-Biomaterialien direkt oder über elektrochemische Signale detektieren kann.

Die vorliegende Erfindung überwindet die Beschränkungen des Stands der Technik, bei dem CNTs durch Wachstum, ausgehend von Katalysatoren, die an bestimmten Stellen platziert wurden, gebildet wurden, und erlaubt die Bildung des gewünschten Musters an den gewünschten Stellen bei Umgebungstemperatur. In anderen Worten sind Verfahren, um CNTs an einem Trägermaterial zu befestigen, im Allgemeinen in ein elektrisches Verfahren und ein chemisches Verfahren eingeteilt. Das elektrische Verfahren erlaubt, die Lage der CNTs auf eine relativ freie Art und Weise zu kontrollieren, wohingegen das chemische Verfahren in einem Prozess einsetzt, bei dem ein Trägermaterial mit einer bestimmten funktionellen Gruppe modifiziert ist und dann über eine bestimmte Zeitspanne in CNT-Suspension eingetaucht wird. Deshalb ist es für das chemische Verfahren schwierig, CNT spezifisch nur an den gewünschten Stellen an dem gesamten Trägermaterial zu befestigten.

Um verschiedene Muster durch das Binden von CNTs an die gewünschten Stellen zu formen, müssen die folgenden Anforderungen erfüllt werden: (1) nur bestimmte Abschnitte des Trägermaterials dürfen exponiert sein; (2) sie müssen in CNT-Dispersion über eine lange Zeitspanne hinweg stabil sein; und (3) sie müssen nach der Abscheidung der CNTs vollständig entfernt werden, so dass eine obere Platte, wie z.B. PDMS, auf einfache Art und Weise befestigt werden kann.

Die vorliegende Erfindung überwand die Nachteile des Stands der Technik durch die Bildung eines Trägermaterialmusters unter Verwendung eines Polymers, so dass die Vorteile des chemischen Verfahrens in größtmöglichem Ausmaß nutzbar gemacht werden können. Es ist außerdem möglich, die Probleme des Stands der Technik zu lösen, einschließlich einer Schwierigkeit bei der Polymermusterbildung ("polymer patterning"), verursacht durch einen Mechanismus bei hoher Temperatur, wie z.B. einer chemischen Abscheidung von Plasma aus der Gasphase und einer thermischen chemischen Abscheidung aus der Gasphase, und der Abwesenheit von funktionellen chemischen Gruppen, wie z.B. -COOH, die durch einen Schneidvorgang ("cutting process") in einer starken Säure erhalten werden.

Die Verwendung des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung stellt dahingehend Vorteile bereit, dass exakte Werte gemessen werden können, selbst wenn die Reaktionsstoffe in kleiner Menge vorliegen und dass die Konzentration der ionischen Stoffe, die auf der Oberfläche abgeschieden werden, elektrisch in einer wässrigen Phase gemessen werden kann.

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen im Detail beschrieben werden.

1. Herstellen von CNTs, dotiert mit Goldnanokristallen

1 ist ein schematisches Diagramm, das ein Verfahren zeigt, in welchem CNTs, die in einer starken Säure geschnitten wurden, mit Goldpartikeln über ein Oxidations-Reduktions-Verfahren dotiert werden. Die durch eine starke Säure geschnittenen CNTs haben eine funktionelle Carboxyl(COOH)-Gruppe. Die funktionelle Carboxylgruppe der CNTs wurde an die funktionelle Aminogruppe eines Linkers, der sowohl funktionelle Amino(NH2)-, als auch Thiol (SH)-Gruppen aufweist, gebunden.

Um die Bildung der oben genannten Amidbindung zu beschleunigen, wurden HAMDU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,3-dimethyl-1,3-dimethylenuroniumhexafluorphosphat), DCC (1,3-Dicyclohexylcarbodiimid), HAPyU(O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1:3,3-bis(tetramethylen)uroniumhexafluorphosphat), HATU(O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1:3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat), HBMDU(O-(Benzotriazol-1-yl)-1,3-dimethyl-1,3-dimethylenuroniumhexafluorphosphat) oder HBTU (O-(Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat) vorzugsweise als Kopplungsmittel benutzt und DIEA (Diisopropylethylamin), TMP (2,4,6-Trimethylpyridin) oder NMI (N-Methylimidazol) bevorzugt als Base benutzt.

Ferner, falls Wasser als Lösungsmittel benutzt wird, wird EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamini-propyl)carbodiimidhydrochlorid) vorzugsweise als Kopplungsmittel benutzt und NHS (N-Hydroxysuccinimid) oder NHSS (N-Hydroxysulfosuccinimid) vorzugsweise als ein Co-Kopplungsmittel (Base) benutzt.

Der Linker, der sowohl eine funktionelle Amino- als auch eine Thiolgruppe aufweist, ist vorzugsweise eine chemische Substanz NH2-R1-SH, wobei R1 C1-20-gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellt.

Die mit der funktionalen Thiolgruppe modifizierten CNTs wurden mit Goldnanopartikeln, wie z.B. HAuCl4-, HAuCl4·3H2O-, HAuBr4-, AuCl4K-, AuCl4Na-, AuBr4K- und AuBr4Na- und vorzugsweise HAuCl9-Goldkolloiden umgesetzt, um Goldnukleationsstellen herzustellen, und dann wurden die Goldnanopartikel über eine Ionenextraktionsreaktion, wie in dem folgenden Reaktionsschema 1 gezeigt, reduziert, um die CNTs mit Goldkristallen zu dotieren.

[Reaktionsschema 1]

  • AuCl4(wässr.) + N(C8H17)4+(Toluol) → N(C8H17)4+AuCl4–(Toluol) mAuCl4(Toluol) + n CNT-CONH-C2H4SH(Toluol) + 3me → 4mCl4(wässr.) + (Aum)(CNT-CONH-C2H4SH)n(Toluol)

Schließlich wurden Gold-dotierte leitende CNTs, die eine Form CNT-(CONH-R1-s-Au)r aufweisen, wobei r eine natürliche Zahl größer als 1 ist, erhalten.

Als ein Ersatz für Gold können auch Silber (Ag)-Nanopartikel, Platin(Pt)-Nanopartikel, Eisen(Fe)-Nanopartikel, Nickel(Ni)-Nanopartikel und Kobalt(Co)-Nanopartikel etc. verwendet werden. Die Metallpartikel in einem oxidierten Zustand können auf die CNTs; die mit einer spezifischen funktionellen chemischen Gruppe, wie z.B. einer funktionellen Thiolgruppe, modifiziert sind, durch die Reduktion des Metalls unter Verwendung einer Oxidations-Reduktions-Reaktion dotiert werden (Jiang, K. et al., Nano Lett., 3: 275, 2003).

2. Bildung eines Musters vom Mehrkanal-Typ auf einem Trägermaterial

Um CNTs auf den gewünschten Stellen auf einem Trägermaterial, wie z.B. Glas, einen Siliciumwafer oder Kunststoff, zu immobilisieren, muss ein Muster, das in der Flüssigkeitsphase stabil sein kann, gebildet werden. Man teilt Verfahren zur Bildung des Musters auf dem Trägermaterial in zwei Verfahren ein. Das erste Verfahren ist dasjenige, wobei Teile des Trägermaterials, die auf den CNTs abgeschieden werden sollen, mittels negativem Photoresist enfernt werden, die CNTs auf dem Trägermaterial abgeschieden werden und der verbleibende Photoresist entfernt wird. Das zweite Verfahren ist dasjenige, wobei Teile eines polymeren Trägermaterials, auf denen CNTs abgeschieden werden sollen, durch Photolithographie geätzt werden.

Im konkreten Ablauf, was das erste Verfahren, das negativen Photoresist verwendet, betrifft, kann das allgemeinste Verfahren zur Halbleiterherstellung verwendet werden, welches das Bedecken eines Trägermaterials mit einem Photoresistfilm, wie z.B. SU-8 (Dowcorning Co.), das Entfernen von nur den gewünschten Anteilen des Trägermaterials über einen photolithographischen Prozess, das Abscheiden der CNTs auf den entfernten Abschnitten des Trägermaterials und das Entfernen des verbliebenen Photoresistfilms.

Wie in 2a bis 2d gezeigt, umfasst das zweite Verfahren die Bereitstellung eines Silicium-Substrats (2a), das Auftragen eines Photoresistfilms auf dem Trägermaterial durch Schleuderbeschichtung (2b), das Belichten des resultierenden Trägermaterials durch eine Maske, die eine bestimmte Form aufweist (2c) und das Entwickeln des belichteten Photoresistmusters (2d) und bildet dadurch auf dem Siliciumträgermaterial durch einen photolithographischen Prozess ein erstes Muster. Dann wird ein flüssiges Polymer auf das resultierende Trägermaterial gegossen und bei 50°C etwa 1 Stunde lang semi-gehärtet (semi-cured) (2e) und ein zusätzlicher photolithographischer Prozess wird an dem semi-gehärteten, semi-flüssigen Polymer durchgeführt (2f). Wie in 2g gezeigt, werden die gewünschten Stellen des Polymers, von welchem der Photoresistfilm entfernt worden war, durch Ätzen mit Piranha-Lösung (Schwefelsäure : Salpetersäure = 3 : 1) oder Aqua regia (Schwefelsäure : Wasserstoffperoxid = 10 : 1) etc., entfernt und dann der verbleibende Photoresistfilm wie in 2h gezeigt, entfernt.

Das resultierende semi-gehärtete Polymer wird bei 70°C zwei Stunden lang vollständig gehärtet. Das gehärtete Polymer wird von dem Silicium-Trägermaterial abgelöst und hydrophile Gruppen werden auf der Oberfläche des abgelösten Polymerfilms durch Corona-Entladung gebildet. Wenn der Polymerfilm mit den hydrophilen Gruppen auf einem sauberen Silicium-Trägermaterial befestigt wird, sind nur die gewünschten Stellen des Silicium-Trägermaterials exponiert, so dass CNTs nur auf den gewünschten Stellen auf dem Trägermaterial chemisch abgeschieden werden können.

Wie oberhalb beschrieben, ist das Bilden des gewünschten Musters auf dem Trägermaterial am wichtigsten beim Bilden des CNT-Musters. Andere Verfahren beinhalten ein Verfahren, umfassend das Platzieren eines Stempels, der eine gegebene Form aufweist, auf einem Silicium-Trägermaterial, das Gießen eines flüssigen Polymers auf das Trägermaterial mit dem Stempel und das Härten des gegossenen Polymers. Mehr makroskopisch können nur die gewünschten Anteile des gehärteten Polymerfilms physikalisch entfernt werden, wodurch eine Polymermaske gebildet wird.

Bei den existierenden Biochips mit CNTs wurden CNTs auf bestimmten Stellen auf einem Trägermaterial wachsen gelassen und dazu verwendet, elektrische und optische Messergebnisse bereitzustellen. Jedoch hat die vorliegende Erfindung den Vorteil, dass sie erlaubt, dass CNTs an den gewünschten Stellen eines Trägermaterials befestigt werden oder dort abgeschieden werden.

Wie oberhalb beschrieben, müssen die Biomaterialien in einem flüssigen Zustand aufrecht erhalten werden, wie in 6 bis 8 gezeigt, um Biomaterialien, die an einem Trägermaterial, welches CNTs darauf angeordnet hat, befestigt sind, elektrisch zu detektieren, und eine obere Platte, die bei dieser Detektion erforderlich ist, muss mehrere mm bis mehrere μm an gesichertem Raum aufweisen, in welchem Fluid aufgenommen werden wird. Das Trägermaterial, welches bei dieser Detektion benutzt werden kann, kann aus verschiedenen Polymermaterialien gestaltet sein, wie z.B. Polydimethylsiloxan (PDMS), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC), Polyethylen (PE), Polypropylen (PP) und Polystyrol (PS).

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine elektrische Energiequelle über wenigstens einen leitenden Nanodraht angeschlossen werden, so dass Ladung an jede flüssige Phase angelegt werden kann, die die Ziel-Biomaterialien, die auf dem CNT oder CNT-Chip platziert sind, umfasst, wobei der leitende Nanodraht als ein Einzelatom gemäß der konventionellen Technologie (Kouwenhoven, L., Science, 275:1896, 1997), gestaltet werden kann durch das Formen eines vorgegebenen Musters auf einem leitenden Metall, und das Deponieren eines Drahts, durch welchen ein elektrischer Strom fließen kann, durch Ionenimplantation oder Zerstäuben ("sputtering").

3. Herstellung funktionaler Thiol(-SH)-Gruppen auf einem festen Trägermaterial

In der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren benutzt, welches die Ausbildung eines Photoresists oder Polymermusters auf einem Trägermaterial, wie z.B. Glas, einem Siliciumwafer oder Kunststoff, und dem anschließenden Immobilisieren von Aminoalkyloxysilan auf der Oberfläche des Trägermaterials unter Verwendung des Musters als, eine Maske umfasst, um eine Aminogruppe auf der Oberfläche des Trägermaterials zu exponieren. Als das Aminoalkyloxysilan wird vorzugsweise Aminopropyltriethoxysilan verwendet.

Um eine funktionelle Thiolgruppe auf der Oberfläche des Trägermaterials, das eine immobilisierte Aminogruppe aufweist, zu exponieren, wird eine Amidbindung durch die Reaktion zwischen der Aminogruppe auf dem Trägermaterial und der funktionellen Carboxylgruppe der chemischen Substanz, welche sowohl eine Thiol- als auch eine Carboxylgruppe aufweist, wie z.B. HOOC-R2-SH, wobei R2 C1-20-gesättigte Kohlenwasserstoffe, ungesättigte Kohlenwasserstoffe oder aromatische organische Gruppen darstellt, gebildet. Letztlich wird eine Struktur in der Form Trägermaterial-CONH-R2-SH, die eine exponierte Thiolgruppe aufweist, gebildet.

Bei der Reaktion, um die Amidbindung auszubilden, wird vorzugsweise eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DCC, HATU, HBTU, HAPyU, HAMDU und HBMDU, als Kopplungsmittel benutzt und eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus DIEA, TMP und NMI, vorzugsweise als Base genutzt. Ferner, falls Wasser als Lösungsmittel benutzt wird, wird EDC vorzugsweise als Kopplungsmittel und NHS oder NHSS vorzugsweise als Co-Kopplungsmittel benutzt.

4. Verfahren zur Bildung eines Musters oder Films durch das Abscheiden von CNTs auf einem Trägermaterial.

Zuerst werden CNTs, dotiert mit Gold (Au-CNT-Au) an ein Trägermaterial, welches funktionelle Thiolgruppen auf seiner Oberfläche exponiert hat (Trägermaterial-CONH-R2-SH) gebunden. Zu dieser Zeit wird eine Au-S-Bindung zwischen der funktionellen Thiolgruppe auf der Trägermaterialoberfläche und dem Goldkristall der Gold-dotierten CNTs ausgebildet, so, dass die CNTs auf dem Trägermaterial gebunden werden und dadurch eine Struktur der Form von Trägermaterial-CONH-R2-S-Au-CNT-Au (3a) gebildet wird.

Danach wird das Gold der Gold-dotierten CNTs, welche selektiv an dem Trägermaterial befestigt worden waren, mit einer Thiolgruppe einer chemischen Substanz, dargestellt durch HS-R3-SH, welche ein Linker ist, der funktionelle Thiolgruppen aufweist, umgesetzt und die Gold-dotierten CNTs werden mit der anderen Thiolgruppe des Linkers umgesetzt. Durch derartige Reaktionen wird eine Struktur in der Form Trägermaterial-[CONH-R2-S-Au-CNT-Au-S-R3-S-Au-CNT-Au] ausgebildet (3b).

Daran anschließend wird die chemische Reaktion zwischen den Gold-dotierten CNTs und der chemischen Substanz, die doppelt funktionelle Thiolgruppen aufweist, wiederholt durchgeführt, um die Oberflächendichte der leitenden CNTs auf der Trägermaterialoberfläche zu erhöhen. Letztlich resultiert dies in einem leitenden CNT-Muster oder -Film, der die Struktur Trägermaterial-[CONH-R2-5-Au-CNT-Au-(S-R3-S-Au-CNT-Au)p]q hat, wobei p und q natürliche Zahlen größer als 1 sind (3c bis 3e).

5. Verfahren, um Rezeptoren an leitende CNTs, dotiert mit Gold, zu binden

In der vorliegenden Erfindung sind Biorezeptoren Substanzen, die an Ziel-Biomaterialien binden oder mit diesen reagieren, und vorzugsweise sind sie Substanzen, die als Sonden, fähig zur Detektion dieser Bindung oder Reaktion, dienen. Beispiele solcher Biorezeptoren beinhalten Nukleinsäuren, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Liganden, Enzymsubstrate und Cofaktoren. Die Ziel-Biomaterialien, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, sind Substanzen, fähig, sich durch das Binden von oder die Reaktion mit Biorezeptoren als Ziele zu verhalten, und die Beispiele ihrerseits beinhalten Proteine, Nukleinsäuren, Enzyme und andere Biomoleküle.

4 ist ein schematisches Diagramm, das zeigt, dass verschiedene Biorezeptoren, die funktionelle Gruppen aufweisen, welche an Gold binden oder mit diesem reagieren, an der Oberfläche von CNTs, dotiert mit Gold-Nanopartikeln, befestigt werden und dann selektiv mit verschiedenen Ziel-Biomaterialien wechselwirken. Als die funktionellen Gruppen, die mit den Gold-Nanokristallen reagieren, werden vorzugsweise Thiolgruppen eingeschlossen. In 4 bezeichnen die Bezugszeichen 1 und 2 Biorezeptoren, fähig zur Reaktion mit Ziel-Biomaterialien, und Bezugszeichen 4 bezeichnet Ziel-Biomaterialien, fähig zur Reaktion mit den Biorezeptoren. Ferner bezeichnet Bezugszeichen 3 Oligonukleotide unter den Biorezeptoren und Bezugszeichen 5 bezeichnet komplementäre Nukleinsäuren, fähig zur Hybridisierung mit den Oligonukleotiden, die an dem Metall der leitenden CNTs immobilisiert sind, und Bezugszeichen 6 bezeichnet allgemeine Biomaterialien, die keine Reaktivität aufweisen.

5 zeigt, einen CNT-Au-Substratpeptidkomplex, wobei Substratpeptid (Sp) einer Kinase, die funktionelle Thiolgruppen aufweist, für eine Kinaseenzymreaktion an CNTs, dotiert mit Gold-Nanopartikeln, immobilisiert wird. Die Anwendung dieses Komplexes bei der Phosphorylierung durch verschiedene Kinaseenzyme erlaubt die Messung einer elektrochemischen Änderung von CNTs.

Verfahren, die dazu verwendet werden können, die Reaktion zwischen den Biorezeptoren und den Biomaterialien zu detektieren, beinhalten eine elektrische Detektionsmethode, die im Stand der Technik als das Intrusions-Detektions-System ("intrusion detection system") wohlbekannt ist, ein Resonanzverfahren und ein Verfahren, das einen fluoreszierenden Körper verwendet. Das elektrische Detektionsverfahren, welches elektrische Signale verwendet, wird vorzugsweise verwendet, in welchem Falle eine winzige Änderung der Potentialdifferenz, welche in CNTs während der Reaktion zwischen Biorezeptoren und Biomaterialien auftaucht, durch eine geeignete Schaltung überwacht werden kann.

6. Reaktions-Detektions-System

Die Verwendung einer Prüfstation zur Messung der elektrischen Eigenschaften von Biosensoren und ein Fluoreszenzmikroskop zur Detektion fluoreszierender Substanzen, die in den Biosensoren erzeugt werden, erlaubt die Messung der Reaktionen. Darüber hinaus kann auch das existierende Verfahren verwendet werden, welches das Befestigen eines Radioisotops an den Substanzen der Reaktion, das Reagieren der resultierenden Substanzen und das anschließende Messen der Strahlung auf einer gegebenen Oberfläche unter Verwendung eines Strahlungsmessgeräts umfasst.

Zur Ausnutzung der sensitiven elektrischen Eigenschaften von CNTs wurde unter obigen Verfahren das elektrische Detektionsverfahren in der vorliegenden Erfindung ausgeführt. Da die Messung von Reaktionen aufgrund der Charakteristika von Biomaterialien vorwiegend in einem flüssigem Zustand durchgeführt wird, konzentrierte sich die vorliegende Erfindung auf das Messen der elektrischen Werte von CNTs in einem flüssigen Zustand. Um die Ionenkonzentration von Biomaterialien, die an der Oberfläche von CNTs befestigt sind, zu messen, wurden in der vorliegenden Erfindung drei Verfahren verwendet. Konkret können, wenn der CNT-Au-Substratpeptidkomplex, bei welchem das Substratpeptid eines Kinaseenzyms an die Oberfläche von CNTs, wie in 5 gezeigt, gebunden ist, für eine Kinaseenzymreaktion verwendet wird, die Ionenkonzentrationen von Biomaterialien, die aus der Kinaseenzymreaktion resultieren, durch die folgenden drei Verfahren gemessen werden.

Das erste Verfahren ist eine Oxidations-Reduktions-Reaktion mit einem Apparat, wie z.B. einem Potentiostat, nach der Induktion der Reaktion durch einen speziellen gelösten Stoff zu messen. Das zweite Verfahren ist es, das Konzept eines Kondensators zu verwenden, um über elektrische Kontrolle die Konzentration von Ionen in einer Kondensatorplatte zu messen. Das dritte Verfahren ist es, das Prinzip eines geladenen Körpers auszunutzen, um das Ausmaß, zu welchem die geladenen dünnen Filme einer geladenen Platte gemäß der Intensität der umgebenden Ionen geweitet werden.

Die Oxidations-Reduktions-Reaktion des ersten Verfahrens ist ein elektrochemisches Detektionsverfahren, welches zur Zeit allgemein verwendet wird. Wie in 6 gezeigt, werden Elektroden in eine Flüssigkeit, die einen speziellen gelösten Stoff enthält, eingetaucht, so dass sie die leitenden Leitungen und Biomaterialien, die mit CNTs verbunden sind, decken und die Ergebnisse vor und nach der Reaktion werden mit einem Potentiostat/Galvanostat (Ametech Co.) unter Verwendung von cyclischer Voltametrie, Potentiometrie und Amperometrie gemessen.

Wie in 7 gezeigt, wird bei der Messung der Ionenkonzentrationen unter Verwendung des Prinzips von Kondensatoren gemäß dem zweiten Verfahren ein neues Trägermaterial aus Platin oder Gold auf dem an dem CNT befestigten Trägermaterial angeordnet, wobei dazwischen eine Flüssigkeit eingefügt wird, und mit Elektroden verbunden. In der Lösung verursachte Vibrationen können durch das Eintauchen einer vibrierenden Elektrode in eine Elektrolytenthaltende Lösung und der geeigneten Anwendung eines Gleichstroms und eines Wechselstroms gemessen werden.

Wie in 8 gezeigt, umfasst das dritte Verfahren, das das Prinzip einer geladenen Platte verwendet, das Einfügen einer geladenen Platte in einen Chip, der von einem Polymer bedeckt ist, und das Messen des Ausmaßes, zu welchem die geladenen dünnen Filme der geladenen Platte ausgeweitet werden, mit einem Messgerät.

In diesem Fall wird die Korrelation zwischen einem Elektrolyt und einem elektrischen Strom als "die Konzentration einer wässrigen Elektrolytlösung a die Intensität eines elektrischen Stroms" ausgedrückt. In anderen Worten kann, da die Konzentrationsverteilung von einem Elektrolyt gemäß der Ionenkonzentration von Reaktionsmaterialien, die auf der Oberfläche von CNTs erzeugt werden, proportional zu der Intensität eines elektrischen Stroms ist, die Konzentration von Ionen, gebildet bei dem Mechanismus auf der Unterseite, gemessen werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend in weiterem Detail durch Beispiele beschrieben werden. Es wird jedoch für den Fachmann offensichtlich sein, dass diese Beispiele in größerem Detail für die vorliegende Erfindung präsentiert werden und der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die Beispiele oder durch die Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1: Herstellung von mit Gold (Au)-dotierten CNTs

Einzelwändige Kohlenstoff-Nanotubes (SWNTs) wurden mit einer starken Säure geschnitten und nachfolgend wurden die resultierenden CNTs, die funktionale Carboxylgruppen aufweisen, einer Oxidations-Reduktions-Reaktion in einem zweiphasigen Flüssigkeitssystem unterworfen, um CNTs, dotiert mit Gold-Nanopartikeln, herzustellen (1).

Zuerst wurde mit Hilfe eines Kopplungsmittels (DCC) in einem Ethanol-Lösungsmittel ein Linker (2-Aminoethanthiol), der sowohl eine Amino(-NH2)- als auch eine Thiol(-SH)-Gruppe aufweist, zusammen mit den CNTs, die funktionelle Carboxylgruppen aufweisen, bei Umgebungstemperatur ungefähr 24 Stunden lang gerührt. Goldnukleationsstellen wurden an den Bindestellen am Ende und der Seite von CNTs durch chemische Au-S-Bindungen gebildet.

25 ml einer 0,01%igen Goldkolloidlösung, die eine leicht gelbe Farbe hat, wurde in einen Glasreaktor gefüllt, zu welchem dann eine Lösung von 16,5 ml (0,01665 mmol) N(C8H17)4Br in Toluol langsam gegeben wurde, während die kolloidale Goldlösung rasch gerührt wurde. Bei dieser Reaktion trat die Phasentrennung zwischen Wasser und Toluol auf, und die vermischte Lösung wurde sehr rasch gerührt, bis die Farbe der unteren wässrigen Schicht vollständig verschwand. 2 mg der CNTs mit darauf ausgebildeten Thiolgruppen wurden in 10 ml Toluol dispergiert und langsam zu der oberen Toluolschicht (organische Phase) gegeben. Dann wurde eine Lösung von 20,5 ml (0,0825 mmol) NaBH4 in Wasser unter langsamem Rühren zugegeben. Dieses Reaktionsgemisch wurde rasch bei Umgebungstemperatur 20 Stunden lang gerührt, wonach die organische Toluolphase von der wässrigen Phase über einen Scheidetrichter abgetrennt wurde. Die abgetrennte organische Phase wurde durch einen Polyvinylidenfluorid(PVD)-Membranfilter mit Porengröße von 100 nm filtriert, wobei Toluol und Ethanol mehrere Male zugegeben wurden.

Die filtrierte Probe wurde in dreifach destilliertes Wasser gelegt und mit Ultraschall dispergiert. Die Dispersion wurde bei 2000 UpM 60 Minuten lang zentrifugiert. Nach Entfernen des Überstands wurde die Probe wieder durch einen Membranfilter filtriert und die resultierende Probe vakuumgetrocknet.

Das Goldkristall-dotierte CNT, hergestellt durch das obige Verfahren, wurde mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) und einem Photoelektronenspektroskop mit Röntgenstrahlanregung (XPS) analysiert. 9a ist eine TEM-Photographie, die einen Goldnanokristall-dotierten CNT, erhalten durch Bildung von Thiol (-SH)-Gruppen auf einem CNT, und Umsetzen der gebildeten Thiolgruppen mit Goldkolloiden, zeigt und 9b ist eine TEM-Photographie, die ein CNT, erhalten durch Umsetzen eines CNTs, der keine Thiol(-SH)-Gruppen ausgebildet hat, mit Goldkolloiden, zeigt. Von diesen Photographien konnte gefunden werden, dass die Goldkristalle, die auf dem CNT mit Thiolgruppen gebildet wurden, in größerer Zahl auf der Seite des CNT dotiert wurden als an dessen Enden und sie wurden auf dem CNT ohne Thiolgruppen nicht dotiert.

10 ist eine HR-TEM-Photographie, die das CNT von 9, vergrößert auf eine hohe Vergrößerung, zeigt. Die regelmäßigen d-Abstände ("d-spacing") der in dieser Photographie gemessenen Gitter war 2,36 ± 0,02 A. Dieser Wert ist dem in der Literatur für die {111}-Ebene von Gold (2,355 A) nahezu gleich (Powder Diffraction Data File 38-1364, Inorganic Phases, JCPDS International Centre for Diffraction Data, Swathmore, PA, 199).

Der Oxidationszustand von Goldkristallen, dotiert auf den CNT, kann auch durch XPS untersucht werden. 11 zeigt ein XPS-Doublett-Spektrum für Goldkristalle, dotiert auf den CNT. Die Doublett-Bindungsenergien von Gold (Au) sind Au 4f5/2 (87, 9 eV) und Au 4f7/2 (84, 2 eV). Diese Werte entsprechen denen für Gold in einem reduzierten Zustand (Au0). Dies legt nahe, dass die meisten Goldkristalle, dotiert auf die CNT-Oberfläche, in einem reduzierten. Zustand und nicht in einem kolloidalen Zustand sind.

Beispiel 2: Detektion einer DNA-Hybridisierungsreaktion unter Verwendung von CNT, dotiert mit Gold

Thiolgruppen-enthaltende DNAs oder Oligonukleotide binden spezifisch an Gold-Nanokristalle, dotiert auf die Wandfläche eines CNT, um einen CNT-Au-DNA-Komplex auszubilden (12a). Das Oligonukleotid-gebundene CNT wurde auf einem Glasobjektträger immobilisiert (Shin-Won Scientific Co. Ltd., Korea), der mit Poly-L-lysin auf dieselbe Art und Weise wie bei der Herstellung von DNA-Chips behandelt worden war (Schena, M. et al., Science 270:467, 1995).

Das Oligonukleotid-gebundene CNT der folgenden SEQ ID NO: 1 wurde mehrere Male durch einen 0,2 μm-Teflonfilter filtriert, um nicht in Reaktion getretene Oligonukleotide zu entfernen. Nach der Filtration wurde die Oligonukleotid-gebundene CNT-Lösung mit einer Zentrifuge konzentriert.

  • 5'-TGT GCC ACC TAC AAG CTG TG (C3)-Thiol-3 (SEQ ID NO: 1)

10 μl der konzentrierten Oligonukleotide wurden mit einer Pipette auf das mit Poly-L-lysin behandelte Glassubstrat getropft und dann bei Umgebungstemperatur mindestens 12 Stunden lang getrocknet. Als nächstes wurde das resultierende Trägermaterial in eine feuchte Kammer gelegt, enthaltend 1 × SSC (0,15M NaCl 0,015M Natriumcitrat) und dort gelassen, bis die getrocknete Substanz auf dem Glassubstrat wegen Sättigung glitzerte (ca. eine Minute lang). Danach wurde es in einen 95°C Ofen gelegt, ihm 3 Sekunden lang zu reagieren erlaubt und es dann mit Hilfe eines UV-Crosslinkersystems (Spectrolinker XL-1500 UV crosslinker) bei 650 mJ immobilisiert.

Die negative Phosphatgruppe (PO4-) von Oligonucleotiden bindet elektrostatisch an die positive Aminogruppe (NH3+) von Poly-L-lysin. Wenn sie mit ultravioletten Strahlen bestrahlt werden und in einem heißen Ofen etwa 3 Sekunden lang getrocknet werden, wird hierauf eine kovalente Bindung ausgebildet, um das CNT auf dem Glasträgermaterial über das Oligomer als einen Linker zu immobilisieren. 12b zeigt, dass CNT-Au-DNA-Komplexe an die Oberfläche des mit Poly-L-lysin behandelten Glasträgermaterials gebunden sind.

Um nicht-umgesetzte Aminogruppen auf einem Glasobjektträger (Corning cop.), dessen Oberfläche mit Aminoproben behandelt worden war, zu blockieren, wurden 6 g Bernsteinsäureanhydrid (Sigma) in 350 ml 1-Methyl-2-pyrrilidinon (Sigma) gelöst. Nachdem das Bernsteinsäureanhydrid vollständig gelöst war, wurden 15 ml 1 M Borax (pH 8,0) zugegeben und der Glasobjektträger darin 15 Minuten lang eingetaucht. Zu dieser Zeit ist das Bernsteinsäureanhydrid an den Aminogruppen auf dem Glasobjektträger befestigt, um eine blockierende Rolle zu spielen.

Danach wurde der resultierende Glasobjektträger bei 95°C eine Minute lang in ultrareines Wasser eingetaucht, ihm 2 Minuten lang eine Reaktion in Ethanol ermöglicht, bei 600 rpm zentrifugiert und danach getrocknet, um einen Überschuss an Lösungsmittel zu entfernen.

Der wie oberhalb beschrieben präparierte Chip wurde in ein Lösungsgemisch aus 3,5 × SSC (0,525 M NaCl, 0,0525 M Natriumcitrat, pH 7,0), 0,1% SDS, und 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) gelegt, ihm 20 Minuten lang bei 50°C die Reaktion ermöglicht, zweimal in ultrareines destilliertes Wasser für jedes Mal eine Minute eingetaucht, und dann eine Minute lang in Isopropylalkohol eingetaucht. Danach wurde bei 600 rpm 5 Minuten lang eine Zentrifugation durchgeführt, um einen auf dem Chip verbleibenden Überschuss an Lösung zu entfernen.

Der angefertigte DNA-Chip wurde in eine Hybridisierungskammer gelegt und eine Hybridisierungslösung wurde dort, wo das CNT befestigt worden war unter Verwendung einer Pipette aufgetropft. Dann wurde ein Deckgläschen darauf gelegt. Hierbei wurde die Hybridisierungslösung für 32 μl einer Lösung, enthaltend ein Oligonucleotid von komplementärer Sequenz präpariert, um ein Gesamtvolumen von 40 μl bei einer Endkonzentration von 3 × SSC (0,45 M NaCl, 0,045 M Natriumcitrat) und 0,3% SDS (Natriumdodecylsulfat) zu betragen. Die komplementäre Oligonucleotidsequenz war die folgende SEQ ID NO 2, die an ihrem Ende FITC (Fluoreszinisothiocyanat) befestigt hatte.

  • SEQ ID NO 2:5'-CAC AGC TTG TAG GTG GCA CA FITC 3'

Um nicht-spezifische Bindungen von den doppelsträngigen Oligonucleotiden zu entfernen, wurde die Lösung 2 Minuten lang bei 100°C belassen, gefolgt von einer zweiminütigen Zentrifugation bei 12.000 Upm. Um die Hybridisierungslösung vor dem Austrocknen in der Hybridisierungskammer zu bewahren, wurden 30 μl von 3 × SSC (0,45 M NaCl, 0,045 M Natriumcitrat) in jede der Aussparungen an beiden Enden der Hybridisierungskammer platziert. Die Kammer wurde mit einem Deckel zugedeckt und 10 Stunden lang in einem Bad mit konstanter Temperatur bei 55°C stehen gelassen.

Nach 10 Stunden wurde die Hybridisierungskammer aus dem Bad mit konstanter Temperatur genommen, 2 Minuten lang in 2 × SSC-Lösung eingetaucht und dann in eine gemischte Lösung von 0,1 × SSC (0,015 M NaCl, 0,0015 M Natriumcitrat) und 0,1% SDS 5 Minuten lang eingetaucht und schließlich 5 Minuten lang in 0,1 × SSC. Um die auf dem Chip verbleibende Lösung zu entfernen, wurde der Chip in eine Zentrifuge gelegt und 5 Minuten lang bei 600 Upm zentrifugiert.

Das Fluoreszenzabbild wurde unter Verwendung eines konfokalen ScanArray 500 (Packard BioScience, BioChip Technologies LLC)-Mikroskops und der QuantArray Microarray Analysis Software erhalten.

Es wurde bestätigt, dass die Fluoreszenz deutlich und gleichförmig war, wenn das Oligonucleotid mit der zu dem CNT-DNA-Chip komplementären Sequenz hybridisiert wurde (linke Seite von 13(a)). Allerdings wurde bei dem CNT-Muster ohne dem darauf befestigten Oligonucleotid und bei dem CNT-DNA-Chip, hybridisiert mit dem Oligonucleotid mit der komplementären Sequenz, keine Fluoreszenz beobachtet (Mitte und rechte Seite von 13(a)). Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass die nichtspezifische Reaktion so gut wie nie vorkam.

Ferner wurde, wie in 13(b) gezeigt, Oligonucleotid an einem Glasträgermaterial, beschichtet mit CNT, befestigt, und dann wurde Oligonucleotid mit der nicht-komplementären Sequenz und Oligonucleotid mit der komplementären Sequenz hybridisiert. Als Ergebnis war es möglich, zweifellos zwischen der hybridisierten Probe und der nicht-hybridisierten Probe zu unterscheiden.

Wie oberhalb im Detail beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung die Metall-dotierten leitenden CNTs, die eine viel höhere elektrische Leitfähigkeit als die der existierenden CNTs aufweisen, bereit und auch ein Muster oder ein Film der leitenden CNTs. Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung den Biosensor, worin Biorezeptoren, die mit Biomaterialien reagieren an einem leitenden CNT-Muster oder Film befestigt sind, bereit.

Der leitende CNT-Biosensor gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine große Oberfläche und exzellente elektrische Leitfähigkeitseigenschaften, so dass es möglich wird, die immobilisierte Menge an Biomolekülen, wie z.B. DNA zu erhöhen und die Nachweisempfindlichkeit für die Biomoleküle zu verbessern. Weiterhin kann er durch die direkte Dedektion verschiedener Zielbiomoleküle oder das Messen elektrochemischer Signale präzise die Reaktionen zwischen Biomaterialien und Biorezeptoren von großen Mengen in einem Schritt detektieren.

Außerdem entspricht der erfinderische Biosensor der Anforderung, dass Biomaterialien aufgrund ihrer charakteristischen Eigenschaften vorwiegend mit einer kleinen Probenmenge in einem flüssigen Zustand gemessen werden müssen. Zusätzlich ist es dem erfinderischen Biosensor möglich eine elektrische Dedektionsmethode fähig zur Bereitstellung präziser Messergebnisse zu verwenden. SEQUENZPROTOKOLL