Title:
Verfahren zur Zellanalyse und Zellanalyseeinrichtung
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur Zellanalyse mit einer Zellanalyseeinrichtung mit Mitteln zum Halten und Transportieren eines Trägers, auf den die zu analysierenden Zellen haftend aufgebracht sind, umfassend wenigstens zwei Behandlungsstationen, insbesondere Färbestationen, in denen die Zellen derart behandelt werden können, dass sich ihre optisch messbaren Eigenschaften ändern, und Mittel zum Erzeugen digitaler Bilder der auf dem Träger befindlichen Zellen nach jeder Behandlung in einer Behandlungsstation,
– wobei die zu analysierenden Zellen mittels eines ersten Färbemittels angefärbt werden und
– wobei ein erstes digitales Bild der auf dem Träger aufgebrachten angefärbten Zellen erzeugt und gespeichert wird,
– wobei dieselben Zellen auf demselben Träger nach der Aufnahme des ersten digitalen Bildes mit einem zweiten Färbemittel behandelt werden, so dass sich ihre optisch messbaren Eigenschaften ändern,
– worauf ein zweites digitales Bild der selben auf dem Träger aufgebrachten Zellen erzeugt und gespeichert wird und verschiedene digitale Bilder derselben Zellen automatisch derart verändert werden, dass sich bei Darstellung verschiedener Bilder derselben Zellen auf einer Ausgabeeinrichtung in jedem dargestellten Bild dieselben Zellen an derselben Relativposition im dargestellten Bild befinden und/oder vor der Erzeugung verschiedener digitaler Bilder derselben Zellen der die Zellen tragende Träger derart ausgerichtet wird, dass sich in den Bildern dieselben Zellen jeweils an der selben Relativposition befinden.




Inventors:
Stockhausen, Jens (52074, Aachen, DE)
Böcking, Alfred, Prof. Dr. med. (40225, Düsseldorf, DE)
Meyer-Ebrecht, Dietrich, Prof. Dr. (52062, Aachen, DE)
Application Number:
DE10128552A
Publication Date:
01/22/2015
Filing Date:
06/13/2001
Assignee:
Stockhausen, Jens, 52074 (DE)
Böcking, Alfred, Univ.-Prof. Dr.med., 40225 (DE)
Meyer-Ebrecht, Dietrich, Univ.-Prof. Dr., 52062 (DE)
Domestic Patent References:
DE69031682T2N/A1998-03-05
DE19709348A1N/A1997-12-04
DE3836716A1N/A1990-05-03



Foreign References:
55410641996-07-30
60079961999-12-28
WO1990003440A11990-04-05
Attorney, Agent or Firm:
Castell, K., Dipl.-Ing. Univ. Dr.-Ing.; Reuther, M., Dipl.-Phys., Pat.-Anw., 52349, Düren, DE
Claims:
1. Verfahren zur Zellanalyse mit einer Zellanalyseeinrichtung mit Mitteln zum Halten und Transportieren eines Trägers, auf den die zu analysierenden Zellen haftend aufgebracht sind, umfassend wenigstens zwei Behandlungsstationen, insbesondere Färbestationen, in denen die Zellen derart behandelt werden können, dass sich ihre optisch messbaren Eigenschaften ändern, und Mittel zum Erzeugen digitaler Bilder der auf dem Träger befindlichen Zellen nach jeder Behandlung in einer Behandlungsstation,
– wobei die zu analysierenden Zellen mittels eines ersten Färbemittels angefärbt werden und
– wobei ein erstes digitales Bild der auf dem Träger aufgebrachten angefärbten Zellen erzeugt und gespeichert wird,
– wobei dieselben Zellen auf demselben Träger nach der Aufnahme des ersten digitalen Bildes mit einem zweiten Färbemittel behandelt werden, so dass sich ihre optisch messbaren Eigenschaften ändern,
– worauf ein zweites digitales Bild der selben auf dem Träger aufgebrachten Zellen erzeugt und gespeichert wird und verschiedene digitale Bilder derselben Zellen automatisch derart verändert werden, dass sich bei Darstellung verschiedener Bilder derselben Zellen auf einer Ausgabeeinrichtung in jedem dargestellten Bild dieselben Zellen an derselben Relativposition im dargestellten Bild befinden und/oder vor der Erzeugung verschiedener digitaler Bilder derselben Zellen der die Zellen tragende Träger derart ausgerichtet wird, dass sich in den Bildern dieselben Zellen jeweils an der selben Relativposition befinden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte Behandeln derselben Zellen auf demselben Träger insbesondere mit einem Färbemittel zwecks Änderung optisch messbarer Eigenschaften der Zellen und Erzeugen und Speichern eines digitalen Bildes der auf dem Träger aufgebrachten Zellen mehrfach mit jeweils unterschiedlichen Behandlungsmethoden der Zellen, insbesondere mit unterschiedlichen Färbemitteln wiederholt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen nach wenigstens einem Verfahren aus der folgenden Gruppe von Verfahren angefärbt werden: May-Grünwald-Giemsa-Färbung oder Papanicolaou-Färbung, Feulgen-Färbung, Silber-Färbung, Peroxidase-Färbung, supravitale Färbung.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die auf dem Träger aufgebrachten Zellen zuerst einer May-Grünwald-Giemsa-Färbung oder Papanicolaou-Färbung, dann einer Feulgen-Färbung, dann einer Silber-Färbung unterzogen werden, wobei nach jeder Färbung ein digitales Bild der Zellen erzeugt und gespeichert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen auf den Träger in einer so dünnen Schicht (Monolayer) aufgebracht werden, dass die Zellen einander im wesentlichen nicht überlappen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die digitalen Bilder einer automatischen Bildanalyse unterzogen werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei der automatischen Bildanalyse mehrere digitale Bilder derselben Zellen nach unterschiedlichen Behandlungen, insbesondere nach unterschiedlichen Färbungen kombiniert und insbesondere überlagert werden.

Description:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zellanalyse, wobei die zu analysierenden Zellen auf einem Träger haftend aufgebracht und mittels eines ersten Färbemittels angefärbt werden und wobei ein erstes digitales Bild der auf den Träger aufgebrachten angefärbten Zellen erzeugt und gespeichert wird.

Solche Analyseverfahren und Analyseeinrichtungen sind in vielfältiger Form seit langem bekannt, beispielsweise aus der EP 0 534 948 B1, der DE 36 42 209 A1 und der DE 37 37 649 A1. In diesen Druckschriften werden jeweils Verfahren und Vorrichtungen beschrieben, bei denen die zu analysierenden Zellen auf einem Träger haftend aufgebracht und verschiedenen Behandlungen unterzogen werden, um bestimmte Eigenschaften der Zellen herauszufinden.

Diese Behandlungen schließen insbesondere das sogenannte ”Anfärben” der Zellen ein, bei dem die Zellen mit einer chemischen Substanz in Kontakt gebracht werden, die bei den Zellen je nach deren Eigenschaften unterschiedliche chemische Reaktionen auslöst, die sich üblicherweise in einer Änderung optisch wahrnehmbarer Eigenschaften der Zellen niederschlägt und das Transmissions-, Absorptions- und/oder Lumineszenzverhalten der Zellen verändert. Im einfachsten Fall verändern die Zellen in Abhängigkeit von ihren Eigenschaften ihre Farbe, so dass die Zellen anhand ihrer Farbe in verschiedene Kategorien wie insbesondere normal/anomal eingeteilt werden können.

Dabei sei an dieser Stelle betont, dass im folgenden in dieser Anmeldung zwar immer nur von einem ”Anfärben” mittels eines ”Färbemittels” gesprochen wird, dass darunter jedoch alle Arten von Behandlungen der auf einem Träger haftend aufgebrachten Zellen zu verstehen sind, die das Emissions-, Transmissions- und/oder Absorptionsverhalten der Zellen bzgl. elektromagnetischer Wellen, insbesondere bzgl. elektromagnetischer Wellen mit Wellenlängen im sichtbaren Bereich verändern. ”Anfärben” in diesem Sinne kann also insbesondere auch heißen, dass die Zellen nicht einer chemischen, sondern einer physikalischen Behandlung wie z. B. einer Bestrahlung oder einer Wärmebehandlung ausgesetzt werden.

Aus den genannten Druckschriften und auch aus benachbarten Gebieten wie z. B. der automatischen Analyse angefärbter Flüssigkeiten, die nicht auf einem Träger aufgebracht sind, sondern sich z. B. in Röhrchen oder ähnlichen Behältern befinden, sind unterschiedliche Verfahren zur automatischen Analyse der aufgenommenen digitalen Bilder mit Methoden der modernen Bildverarbeitung bekannt, so z. B. aus derDE 44 04 896 A1, der EP 0 347 210 B1 oder der DE 42 09 127 A1.

Dabei ist aus der DE 44 04 896 A1, die sich allerdings nicht auf einen Träger haftend aufgebrachte Zellen, sondern in kleinen Gefäßen befindliche Flüssigkeitsproben betrifft, auch bekannt, dass die Proben vor dem Anfärben einer ersten Analyse daraufhin unterzogen werden, ob sie sich überhaupt für eine aussagekräftige Färbereaktion eignen. Nur die Proben, die bei der ersten Analyse als geeignet klassifiziert wurden, werden sodann automatisch mit einem Färbemittel verrührt und der weiteren Analyse unterzogen.

Je nach Art und Beschaffenheit der zu analysierenden Zellen kann es sein, dass das Anfärben der Zellen mit nur einem einzigen Färbemittel unterschiedliche Eigenschaften der Zellen noch nicht in der zur Analyse, insbesondere zur sicheren Diagnose bestimmter Krankheiten notwendigen Klarheit herausbringt.

In der Literatur sind zur Lösung dieses Problems zwei unterschiedliche Wege beschrieben worden. So wird in den bereits genannten Druckschriften DE 37 37 649 A1 und EP 0 534 948 B1 vorgeschlagen, die auf dem Träger haftenden Zellen mit einer ersten und einer zweiten Substanz zu behandeln, wobei die erste und die zweite Substanz miteinander Wechselwirken und dadurch unterschiedliche Eigenschaften in den Zellen deutlich sichtbar machen.

In der ebenfalls bereits genannten DE 36 42 209 A1 wird zur Verbesserung der Analyseergebnisse vorgeschlagen, die zu analysierenden Zellen auf mehrere verschiedene Träger zu verteilen und diese dann jeweils unterschiedlichen Färbebehandlungen zu unterziehen, so dass schließlich zu Zellen, die aus ein und derselben Probe stammen, unterschiedliche Daten vorliegen, die dann gemeinsam analysiert werden können.

Allerdings besteht oftmals das Problem, dass sich Zellen aus ein und derselben Probe auf unterschiedlichen Trägern unterschiedlich entwickeln. Jede Analyse liefert damit nur Informationen über die jeweils speziell gefärbten Zellen, während es wünschenswert wäre, genau über diejenigen Zellen, über die bereits Informationen aus einer ersten Analyse vorliegen, weitere Informationen zu gewinnen.

Ein derartiges Verfahren ist aus der DE 197 09 348 A1 bekannt. Hierbei werden auf dem Objektträger unter dem Mikroskop Zellen unterschiedlich eingefärbt. Dies ist jedoch insbesondere für eine routinemäßige Untersuchung nicht geeignet, da Färbeverfahren in der Regel lange Einwirkzeiten erfordern und das Mikroskop dann während dieser Zeit nicht anderweitig genutzt werden kann.

Ein automatisiertes Analysesystem ist aus der DE 690 31 682 T2 bekannt. Dieses System erlaubt es jedoch nicht, die gleichen Zellen unterschiedlich einzufärben.

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Zellanalyse anzugeben, das es in besonders einfacher Weise erlaubt, unterschiedliche, sich ergänzende Aussagen über ein und dieselben Zellen zu erhalten.

Die Aufgabe wird von einem Verfahren der eingangs genannten Art mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. Die Erfindung basiert also auf der überraschenden Erkenntnis, dass auch im Routinebetrieb bereits mit einem Färbeverfahren behandelte Zellen weiteren Färbereaktionen unterzogen werden können, wodurch neue, wichtige Erkenntnisse über die untersuchten Zellen gefunden werden können.

Dabei hat sich gezeigt, dass die Verfahrensschritte Behandeln derselben Zellen auf demselben Träger insbesondere mit einem Färbemittel zwecks Änderung optisch messbarer Eigenschaften der Zellen und Erzeugen und Speichern eines digitalen Bildes der auf dem Träger aufgebrachten Zellen auch mehrfach mit jeweils unterschiedlichen Behandlungsmethoden der Zellen, insbesondere mit unterschiedlichen Färbemitteln wiederholt werden können, denn bei Verwendung üblicher Glas- oder Kunststoffträger haften die Zellen sehr gut auf dem Träger und überstehen ohne nennenswerte Verluste auch mehrere der ihre optisch messbaren Eigenschaften ändernden Behandlungen. Da bei den hier in Frage stehenden Zellanalyseverfahren typischerweise weit mehr als 1000 Zellen auf einen Träger aufgebracht werden, würde es die Signifikanz der Analyse nicht verändern, wenn sich einige Zellen bei den aufeinanderfolgenden Behandlungen vom Träger lösen sollten.

Die zu analysierenden Zellen werden meist menschlichen Ursprungs sein und z. B. Abstrichen, Feinnadelpunktasen oder beliebigen Körperflüssigkeiten entstammen. Zur Analyse solcher Zellen hat sich die folgende Gruppe von Verfahren zum Anfärben besonders bewährt: May-Grünwald-Giemsa-Färbung oder Papanicolaou-Färbung, Feulgen-Färbung, Silber-Färbung, Peroxidase-Färbung, supravitale Färbung.

Handelt es sich um menschliche Zellen, so hat es sich für die Tumordiagnostik besonders bewährt, die auf dem Träger aufgebrachten Zellen zuerst einer May-Grünwald-Giemsa-Färbung oder Papanicolaou-Färbung, dann einer Feulgen-Färbung, dann einer Silber-Färbung unterzogen werden, wobei nach jeder Färbung ein digitales Bild der Zellen erzeugt und gespeichert wird.

Die digitalen Bilder können in beliebiger, an sich bekannter Weise weiterverarbeitet und ausgewertet werden. Insbesondere können sie einer automatischen Bildanalyse unterzogen werden, wobei vorteilhaft mehrere digitale Bilder derselben Zellen nach unterschiedlichen Behandlungen, insbesondere nach unterschiedlichen Färbungen kombiniert und insbesondere überlagert werden können. Auf die so erzeugten kombinierten und/oder überlagerten Bilder können dann Klassifizierungsalgorithmen angewandt werden, die die Zellen nach vorgebbaren Kriterien klassifizieren, zählen und ggf. nach Abfrage einer vorzugsweise selbstlernenden Datenbank Ergebnisse der Analyse ausgeben.

Die nach jeweils verschiedenen Behandlungen der Zellen aufgenommen Bilder können softwaremäßig ”gematcht” werden, so dass sich bei Darstellung verschiedener Bilder derselben Zellen auf einer Ausgabeeinrichtung in jedem dargestellten Bild dieselben Zellen an derselben Relativposition im dargestellten Bild befinden, was insbesondere einem menschlichen Betrachter die vergleichende Analyse der Bilder erleichtert. Da die Zellen ihre Position auf dem Träger praktisch nicht verändern, kann jedoch auch bereits durch entsprechendes Ausrichten des Trägers vor der Erzeugung verschiedener digitaler Bilder derselben Zellen sichergestellt werden, dass sich in den Bildern dieselben Zellen jeweils an der selben Relativposition befinden.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden rein beispielhaften und nicht-beschränkenden Beschreibung in Verbindung mit der Zeichnung. Es zeigen:

1 ein tatsächliches Bild von auf einem nicht weiter sichtbaren Träger aufgebrachten Zellen, die im May-Grünwald-Giemsa-Verfahren angefärbt wurden.

2 ein tatsächliches Bild der selben Zellen gemäß 1 nach der nachträglichen Behandlung im Feulgen-Verfahren und

3 ein tatsächliches Bild der selben Zellen gemäß 2 nach einer nachträglichen Silber-Färbung.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden: Zellen aus einem Abstrich oder einer Punktion werden auf einem Objektträger aufgebracht, und zwar vorzugsweise in einer so dünnen Schicht (Monolayer), dass die Zellen einander im Wesentlichen nicht überlappen. Das Präparat wird dann mit der für die visuelle Betrachtung vorgesehenen May-Grünwald-Giemsa-Färbung oder Papanicolaou-Färbung angefärbt. Es ergibt sich ein Bild wie in 1 gezeigt, das im Ganzen oder auch nur teilweise gespeichert und bei weiteren Analyseschritten verwendet werden kann.

Beispielsweise kann so vorgegangen werden, dass eine Bedienperson den Träger in vergrößerter Darstellung auf einem Bildschirm betrachtet und bestimmte Gebiete (ROIs – Regions of Interest) festlegt und markiert, die von besonderer Signifikanz zu sein scheinen und deren Veränderung bei den nachfolgenden Behandlungen beobachtet werden soll. Je nach Art der zu untersuchenden Zellen und des in computerisierter Form vorhandenen Expertenwissens können solche ROIs natürlich auch automatisch festgelegt werden.

Die auf dem Träger aufgebrachten Zellen werden sodann einer weiteren Behandlung unterzogen, bei der sich ihre optisch messbaren Eigenschaften erneut ändern, beispielsweise einer Feulgen-Färbung, die zur Bestimmung des DNA-Gehaltes der Zellen dient. 2 zeigt das Bild der Zellen gemäß 1 so, wie es sich nach der Feulgen-Färbung darstellt. Je nach Durchführungsform des Verfahrens, der Art der untersuchten Zellen und der Anzahl der auf dem Träger aufgebrachten Zellen wird dabei entweder ein Bild aller Zellen oder nur der ausgewählten ROIs gespeichert.

Es können dann noch weitere Behandlungen, beispielsweise eine weitere Färbung der Zellen folgen. Unterzieht man die in den 1 und 2 gezeigten Zellen einer Silber-Färbung, ergibt sich ein Bild wie in 3 gezeigt. Man beachte, dass sich in den 1 bis 3 dieselben Zellen an jeweils derselben Relativposition im Bild befinden, so dass für den Betrachter ein unmittelbarer Vergleich einzelner Zellen nach den unterschiedlichen Behandlungen möglich ist.

Für den Fachmann ist klar, dass die nach den einzelnen Behandlungen der Zellen aufgenommen Bilder in unterschiedlicher Weise kombiniert und korreliert werden können, und zwar sowohl zur automatischen Bildanalyse als auch zur Darstellung der Bilder bzw. eines daraus erzeugten Bildes auf einer Ausgabeeinheit wie einem Bildschirm oder einem Drucker.

Im Rahmen des Erfindungsgedankens sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen möglich, die sich z. B. auf die Verarbeitung und Auswertung der digitalen Bilder beziehen, wobei an dieser Stelle betont sei, dass die Bilder zwar zweckmäßigerweise direkt in digitalisierter Form erzeugt werden, beispielsweise mittels eines Arrays von CCD-Zellen, dass es jedoch durchaus möglich ist, zunächst ein analoges Bild aufzunehmen und dieses anschließend zwecks automatischer Bildanalyse zu digitalisieren. Auch die entsprechenden Zellanalyseeinrichtungen können in unterschiedlichster Form ausgebildet und so vorteilhaft an den jeweiligen Einsatzzweck und Einsatzort angepasst werden. Beispielsweise sind kleine mobile Einrichtungen ebenso denkbar wie auf die Analyse vieler tausend Proben pro Tag ausgelegte Einrichtungen zum Einsatz bei professionellen Analyselaboren. Ein erfindungswesentlicher Grundgedanke ist jedenfalls, die auf einem Träger aufgebrachten Zellen nacheinander verschiedenen, optisch messbare Eigenschaften der Zellen ändernden Behandlungen zu unterziehen und die nach jeder Behandlung gewonnen Bilder der Zellen zu korrelieren.