Title:
Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen in Rasteranordnungen
Kind Code:
B4


Abstract:

Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen (MS), dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Strukturen (MS) einen Gesamtdurchmesser zwischen 0,1 Nanometer und 200 Nanometer aufweisen und in Form von Rastern zusammen mit Kalibrierungssubstanzen (K1, K2, ...) auf einem nanolithographisch reaktiven Träger (RT) angeordnet werden.




Inventors:
Cremer, Christoph, Prof. (69126, Heidelberg, DE)
Grunze, Michael, Prof. (69151, Neckargemünd, DE)
Application Number:
DE10052823A
Publication Date:
11/20/2014
Filing Date:
10/24/2000
Assignee:
Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, 69120 (DE)
International Classes:
Domestic Patent References:
DE69032888T2N/A1999-07-29
DE19830596A1N/A1999-01-14



Foreign References:
WO1998028592A11998-07-02
WO2000036398A22000-06-22
Other References:
ECK, W., et al.: Generation of Surface Amino Groups on Aromatic Self-Assembled Monolayers by Low Energy Electron Beams - A First Step Towards Chemical Lithography. In: Advanced Materials, Vol.12, Iss.11, Juni 2000, S.805-S.808
GEYER,W., et al.: Electron-induced crosslinking of aromatic self- assembled monolayers: Negative resists for nanolithography. In: Applied Physics Letters, Vol.75, No.16, 18. Oct. 1999, S.2401-S. 2403
Claims:
1. Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen (MS), dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Strukturen (MS) einen Gesamtdurchmesser zwischen 0,1 Nanometer und 200 Nanometer aufweisen und in Form von Rastern zusammen mit Kalibrierungssubstanzen (K1, K2, ...) auf einem nanolithographisch reaktiven Träger (RT) angeordnet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Strukturen (MS) biologische Makromoleküle wie Proteine, biologische oder synthetische Membranen, Oligonucleotide, DNS, RNS, mRNS, Genomstrukturen und/oder andere makromolekulare Bestandteile von Zellen und/oder technische Mikrostrukturen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein nanolithographisch reaktiver Träger (RT) mit einer reaktiven Oberfläche (RO) verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der reaktive Träger (RT) mit einer reaktiven Oberfläche (RO) mittels lithographischer Techniken und Materialien kontrolliert modifiziert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Bereich (KAL) des reaktiven Trägers durch nanolithographische Verfahren ein Muster (K1) mit reaktiven Features (KF1.1, KF1.2, KF1.3, ..., KF1.N, KF2.1, ..., KFM.N) erzeugt wird, deren Ausdehnung in einer oder mehreren Raumrichtungen erheblich kleiner als die durch die optische Auflösung des für die lichtmikroskopische Analyse verwendeten optischen Systems (OS) ist, bestimmt durch die Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) der Punktbildfunktion (Point Spread Function, PSF) von dem optischen System (OS) in der betreffenden Raumrichtung, und deren Abstand voneinander größer ist als die Halbwertsbreite (FWHM) des verwendeten optischen Systems (OS).

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass durch nanolithographische Verfahren eine oder mehrere Kalibrierungssubstanz/en (K1, K2, ...) mit einer oder mehreren spektralen Signatur/en (Kspecs 1, Kspecs 2, Kspecs 3, ...) an die reaktiven Features (KF1, KF2, KF3, ...) gebunden wird/werden, wobei der geometrische Abstand und die Verteilung zwischen der einen oder den mehreren spektralen Signatur/en und den Kalibrierungssubstanzen bekannt ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass durch nanolithographische Verfahren in einem Bereich (MEAS) des reaktiven Trägers (RT) ein Muster (M1) mit reaktiven Features (MF1.1, MF1.2, ..., MF1.L, MF2.1, MF2.2, ..., MF*) erzeugt wird, wobei der mittlere Durchmesser der reaktiven Features (MF) kleiner/gleich dem mittleren Durchmesser der zu analysierenden Molekularen Strukturen (MS) ist, und der Abstand der reaktiven Features (MF) von einander sowie von den zur Kalibrierung verwendeten reaktiven Features (KF) größer ist als die Halbwertsbreite (FWHM) des verwendeten optischen Systems (OS) in der betreffenden Richtung.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere zu messende molekulare Struktur/en (MS1, MS2, MS3, ..., Messobjekte) an die reaktiven Features (MF) gebunden werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die zu messende/n molekulare/n Struktur/en (MS) an bestimmten chemisch, biochemisch, oder molekularbiologisch identifizierten Stellen mit mindestens zwei spektralen Signaturen (specs 1, specs 2, specs 3, ...) markiert werden, die bevorzugt mit denen zur Markierung der Kalibrierungssubstanz verwendeten identisch sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Abstände und relativen Lagebeziehungen der durch die spektralen Signaturen identifizierten Positionen auf der/den Kalibrierungssubstanz/en bzw. in den Messobjekten nach Verfahren der spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) bestimmt werden, wobei die Kalibrierung der Distanzbestimmung mit Hilfe der spektral markierten Kalibrierungssubstanzen (K1, K2, ...) erfolgt.

Description:

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen mit einem Gesamtdurchmesser zwischen 0,1 Nanometer und 200 Nanometer in Rasteranordnungen.

Vielfältige Forschungsergebnisse haben in den letzten Jahren deutlich gemacht, dass der Zwischenbereich zellulärer ”Nano”-Strukturen mit typischen Abmessungen von etwa 10 Nanometer bis einige hundert Nanometer von größter Bedeutung für Molekulare Medizin und Pharmaforschung/Entwicklung ist. Dies ist der Bereich von komplexen Systemen von biologischen Makromolekülen, bei denen viele einzelne, miteinander in vielfältiger Weise interagierende Untereinheiten zu einem funktionellen Ganzen verbunden sind. Als Beispiele seien genannt die dynamische Nanostruktur von Zell-Zell-Kontakte vermittelnden Komplexen, von membranlokalisierten Proteinkomplexen wie Ionenkanälen oder Kernporen, von Zytoskelett- und Vesikel-assoziierten Komplexen, sowie der Komplexe für Replikation, Transkription, Reparatur und Remodellierung des Genoms.

a) Experimentelle Verfahren

Der in den letzten Jahren erzielte große Fortschritt in der Entwicklung von Verfahren der atomaren Kraftmikroskopie, der optischen Nahfeldmikroskopie, der Fluoreszenzenergietransfermikroskopie, der multispektralen linearen und nicht linearen Laser-Raster-Mikroskopie sowie der spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie, in Verbindung mit neuen, hochspezifischen und effizienten molekularen Markierungstechniken macht es möglich, Fragen der dreidimensionalen (3D) Architektur und Dynamik großer Molekularer Strukturen, wie z. B. von Multiproteinkomplexen, unter Einschluss physiologischen Bedingungen mit Aussicht auf Erfolg anzugehen. Im Vordergrund der beschriebenen Erfindung steht dabei ein Verfahren zur Aufklärung der Topologie von molekularen Strukturen, z. B. großen Multiproteinkomplexen, oder Protein-Nukleinsäurekomplexen von einer unteren Grenze von ca. 10 Nanometern Gesamtdurchmesser bis hin zu einer oberen Grenze von einigen 100 Nanometern (1 Nanometer = 1 × 10–9 m). Auf der Ebene der 3D-„Nano” Struktur kommt der „Anatomie” von supramolekularen Biostrukturen und ihrer Dynamik gegenwärtig eine fundamentale Rolle bei der zielgerichteten Entwicklung neuer Pharmaka zu. Beispielsweise ist zu erwarten, dass eine verbesserte Kenntnis der 3D-Organisation funktionell wichtiger Multiproteinkomplexe, oder von Protein-Nukleinsäurekomplexen, neue Verfahren zu ihrer Kontrolle ergeben wird. Nach dem erfolgreichen Abschluss der ersten vollständigen Sequenzierung des menschlichen Genoms sowie anderer Modellgenome (Genomik) ist eines der gegenwärtig als vordringlichst angesehenen und mit erheblichen Mitteln unterstützen Folgevorhaben die Proteomik, d. h. die Erforschung der Strukturen der aufgrund der DNA-Sequenzinformation gebildeten Proteine und ihrer pharmakologisch relevanten Wechselwirkungen mit einander und mit anderen zellulären Strukturen. Als ein Beispiel sei hier die Erforschung von Transkriptionsrelevanten Multiproteinkomplexen angegeben, die bei der spezifischen Transkription der genetischen Information in Ribonukleinsäuren (RNA) von entscheidender Bedeutung sind. Andere Beispiele aus dem Bereich der Zellkernbiologie betreffen die Multiprotein-Ribonukleinkomplexe, die für das Processing (”Splicing”) der transkribierten RNA in Boten-RNA (m-RNA) verantwortlich sind (Für weitere Beispiele s. oben).

b) Theoretische Modellrechnungen (Biocomputing)

Im Bereich des Biocomputing gibt es gegenwärtig dramatische Entwicklungen, deren Einbeziehung in die Analyse der experimentell gewonnenen Topologiedaten und damit für die Proteomik und die Pharmaforschung von erheblichem Vorteil sein kann. Mathematische Modellierungsmethoden, unterstützt durch computergrafische Visualisierung, haben inzwischen einen hohen Grad an berechenbarer Komplexität erreicht. Diesen Simulationen liegen biochemische oder physikalische Gesetzmäßigkeiten zu Grunde. Bis zu 50.000 Einzelmoleküle lassen sich bis zu einer Zeitdauer von 10 Nanosekunden simulieren. Die Modellierung von Dynamik, Funktion und Biomechanik in molekularbiologischen Anwendungen umfasst bisher u. a.: Protein-Membran-Komplexe, die Regulation und Packung von Proteinen, DNA-Bindungsdomänen, sowie verschiedene Strukturproteine. Durch die mathematische Komplexität ist jedoch eine Beschränkung auf das Verhalten innerhalb enger Grenzen der strukturellen Hierarchie notwendig. Ein wesentliches bei solchen Simulationsrechnungen verfolgtes Ziel der modernen Molekularbiologie und Proteomik ist es, die 3D-Struktur von Komplexen biologischer Makromoleküle bis ins atomare Detail zu bestimmen: Dies ist erforderlich, um die funktionelle Wirkung genau zu verstehen und damit effektiver kontrollieren zu können. Theoretische Modellrechnungen zur Bildung, Umbildung und Auflösung von Multiproteinkomplexen werden zu einem derartigen vertieften Verständnis ihrer 3D-Struktur und Dynamik und damit zu einer Optimierung der Wirkstoffentwicklung wesentlich beitragen. Verfahren des Biocomputing haben es in den letzten Jahren möglich gemacht, auf der Grundlage von atomaren Strukturdaten von einzelnen isolierten Untereinheiten auch sterisch mögliche Strukturen von Komplexen aus solchen Untereinheiten mit hoher ”Auflösung” zu berechnen. Es ergeben sich jedoch oftmals mehrere alternative Struktur-Möglichkeiten, eine experimentelle atomare Auflösung der Topologie von komplexen Molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexen, ist mit den hier beschriebenen Analyseverfahren in absehbarer Zeit zwar kaum erreichbar. Experimentelle Topologie-Messungen mit einer Distanzauflösung von einigen Nanometern kann die Anzahl der mit atomarer Auflösung berechneten ”möglichen” 3D-Strukturen eines Komplexes ganz erheblich einschränken. In günstigen Fällen kann es sogar möglich werden, ein bestimmtes atomar aufgelöstes Modell eines Proteinkomplexes als das einzige mit allen experimentellen Strukturdaten kompatible zu identifizieren. Liegen (hypothetisches Beispiel) zwei mit atomarer Auflösung berechnete Alternativen vor, von denen die eine einen Abstand bestimmter Marker in zwei Untereinheiten A, B von 10 Nanometer, die andere einen Abstand dieser Marker von 20 Nanometer voraussagt, so kann mithilfe höchstauflösender SPDM (Auflösungsäquivalent z. B. 2 Nanometer) eine der zwei Alternativen verworfen werden, so dass nur noch die andere in Frage kommt.

Zur Untersuchung der räumlichen Topologie von molekularen Strukturen, z. B. von Multiproteinkomplexen, werden außerordentlich hohe Strukturauflösungsmethoden benötigt. Da die typischen Abmessungen der individuellen Bereiche (z. B. einzelne Proteinuntereinheiten) im Bereich von 5–10 Nanometer liegen, sind je nach analysiertem Komplex und Zielsetzung Strukturparametermessungen (z. B. 3D-Distanzen zwischen den Schwerpunkten einzelner Untereinheiten von Multiproteinkomplexen oder Multiprotein-Nukleinsäurekomplexen) bis hinunter zu wenigen Nanometern erforderlich. Im Vordergrund der Erfindung stehen insbesondere solche molekularen Strukturen, deren Topologie mit anderen Verfahren (z. B. Elektronenmikroskopie, Röntgenkristallographie, Magnetische Resonanz) nicht oder nur mit unverhältnismäßig großem Einsatz an Sach- und Personalmitteln sowie an Zeit bestimmt werden kann. Beispielsweise setzten kristallographische Untersuchungen die Bildung wenigstens von Mikrokristallen voraus, ein oftmals langwieriges Verfahren; die Elektronenmikroskopie erlaubt ebenso wie die Kristallographie nur in begrenztem Maße die Berücksichtigung physiologischer Bedingungen; Magnetische Resonanzverfahren erlauben zwar Strukturuntersuchungen unter physiologischen Lösungsbedingungen, sind jedoch auf absehbare Zeit auf die Analyse großer Multiproteinkomplexe und anderer vergleichbar großer molekularer Strukturen kaum anwendbar.

Dort, wo die zu untersuchenden molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe, in einer essentiell „zwei-dimensionalen Anordnung” vorliegen, wie bei Kernporenkomplexen in isolierten Membranen, stehen nach dem Stand der Technik verschiedene Verfahren zur Verfügung. Neben klassischen elektronenmikroskopischen Techniken werden hier insbesondere die Atomare Kraftmikroskopie und „Optische Pinzetten”-Verfahren angewandt, die vor allem hochaufgelöste Höhenprofile und deren dynamische Änderungen zu messen gestattet, ggf. in Verbindung mit elektrophysiologischen Funktionsanalysen; in einer Variante dieser Mikroskopiemethode, der Atomaren Kraft-Spektroskopie, sind auch Messungen der Kraftwechselwirkungen zwischen Untereinheiten molekularer Strukturen möglich. Ein weiteres Verfahren mit einem weiter gesteigerten Auflösungspotential ist die Optische Nahfeldmikroskopie. Die genannten Methoden können auch bei begleitenden Untersuchungen an isolierten, d. h. aus ihrem zellulären oder membranösen Kontext herausgelösten molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexen, vorteilhaft angewandt werden. Z. B. kann durch eine solche Analyse ein genaueres Verständnis des Einflusses physikochemischer Parameter (z. B. pH, Ionenkonzentration, Temperaturänderungen, Druck), auf die Topologie des Multiproteinkomplexes gewonnen werden. Bis vor wenigen Jahren war es allgemeine Meinung, dass lichtoptische Ultrastrukturanalysen individueller molekularer Strukturen wegen der auf etwa eine halbe Lichtwellenlänge begrenzten optischen Auflösung von einigen hundert Nanometern aus grundsätzlichen physikalischen Gründen nicht möglich seien. Diese Grenzen der optischen Auflösung können jedoch in vielen Fällen überwunden werden, wenn es gelingt, spezifische Wechselwirkungen des Lichtes mit den zu analysierenden Molekülen zu nutzen. Beispielsweise erlauben Verfahren des „Point Spread Function (PSF) Engineering” gegenwärtig eine fernfeldlichtmikroskopische Auflösung (angegeben als „Full Width at Half Maximum, FWHM, der Punktbildfunktion/”Point Spread Function”, PSF) von 100 nm in alle drei Raumrichtungen. Theoretische Überlegungen zeigen, dass mit derartigen Methoden unter Verwendung von Licht im sichtbaren Spektralbereich noch Auflösungen (FWHM) von 20–30 nm erreicht werden könnten. Ein anderes neues Verfahren von erheblicher Bedeutung für die Analyse molekularer Strukturen betrifft die Optische Nahfeldmikroskopie, mit der in einer fürfluoreszenzoptische Anwendungen geeigneten Anordnung laterale Auflösungen im Bereich von einigen zehn Nanometern erreicht wurden.

Optische Auflösungen (FWHM) von 20–30 nm wären ausreichend, sehr große molekulare Strukturen zumindest teilweise zu analysieren; in vielen Fällen von erheblicher biomedizinischer/pharmazeutischer Relevanz wird jedoch selbst eine optische Auflösung von 20–30 nm für sich alleine genommen nicht ausreichend sein. Mithilfe von spektralen Fluoreszenzresonanzenergietransfermessungen ist es möglich, Distanzen von wenigen Nanometern zwischen zwei Fluorochrom-Positionen in einer Struktur abzuschätzen. Beispielsweise kann auf diese Weise die räumliche Struktur von Chromatin weiter aufgeklärt werden. Diese Technik ist zwar in der Lage, höchstaufgelöste Distanzbestimmungen im gesamten infrage kommenden Bereich von molekularen Strukturen zu machen. Nach dem Stand der Technik erlaubt das Verfahren jedoch nicht, die Topologie vielfach markierter individueller molekularer Strukturen zu analysieren; ferner versagt sie bei Abständen größer als ca. 10 nm. Für eine effektive Topologieanalyse ist es jedoch von großem Vorteil, neben kleineren Abständen (z. B. 3 nm) auch größere Abstände weiter entfernter Bereiche (z. B. 20 nm) detektieren können. Theoretische Verfahren des Biocomputing sind von größter Bedeutung für die Berechnung einer eingeschränkten Zahl „möglicher” Strukturalternativen; sie können die Interpretation experimenteller Messungen an „tatsächlichen” Strukturen wesentlich verbessern, jedoch nicht ersetzen. Zusammenfassend kann festgestellt werden: Der Bedeutung des Problems entsprechend gibt es eine Vielzahl von experimentellen Verfahren zur Struktur- und Topologieanalyse von molekularen Strukturen. Zum Teil sind diese Verfahren jedoch nur zur Analyse relativ großer Abstände bzw. sehr kleiner Abstände geeignet, oder sie einen erheblichen Personal- und Zeitaufwand und sind daher für Analysen von zahlreichen molekularen Strukturen in relativ kurzer Zeit nicht optimal.

WO 98/28592 A1 beschreibt ein Verfahren und Vorrichtungen für die Fernfeldmikroskopie und Flussfluorometrie zur geometrischen Distanzmessung zwischen fluorochrommarkierten Objektstrukturen, wobei die Distanzen geringer sein können als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion. DE 198 30 596 A1 beschreibt ein Wellenfeldmikroskop mit einem Beleuchtungs- bzw. Anregungssystem, das wenigstens eine reelle und eine virtuelle Beleuchtungsquelle und wenigstens ein Objektiv umfasst, wobei Beleuchtungsquellen und Objektiv(e) derart zueinander angeordnet sind, dass sie zur Erzeugung eines eindimensionalen stehenden Wellenfeldes geeignet sind, mit einem Objektraum, der Halte und Manövriervorrichtung(en) für ein Objekt umfasst, und mit einem Detektionssystem, das ein Objektiv, ein Okular und einen Detektor umfasst. WO 00/36398 A2 beschreibt Verfahren und Vorrichtungen zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz-Reaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger direkt oder indirekt gebundenen Molekülen.

Die hier beschriebene Erfindung hat die Analyse der Topologie der supramolekularen Biostruktur und Dynamik solcher biochemisch, molekularbiologisch und zellbiologisch bereits charakterisierter „Cluster” von funktionellen biologischen Makromolekülen mit schwacher Wechselwirkung der Untereinheiten (z. B. Multiproteinkomplexen) zum Ziel. Überschreiten die Abmessungen eines einzelnen biologischen Makromoleküls in wenigstens einer Richtung eine Größe von 10 nm, so ist auch die Analyse eines einzelnen Moleküls erfindungsgemäß. Erfindungsgemäß sind ferner Analysen synthetisch hergestellter oder mit biotechnologischen oder chemischen Verfahren modifizierter anderer Makromoleküle und Makromolekülkomplexe, die in natürlichen biologischen Systemen nicht vorkommen, sofern die hier beschriebenen Analyseverfahren angewandt werden. Im Folgenden sollen alle genannten Makromoleküle/Makromolekülkomplexe abkürzend als „molekulare Strukturen” bezeichnet werden. Unter „Topologie” wird im Folgenden die relative Lage von geeignet gekennzeichneten („markierten”) Bereichen der molekularen Struktur bezeichnet, zum Beispiel die durch geometrische Distanzbeziehungen gekennzeichneten Lagebeziehungen von markierten Untereinheiten in einem Multiproteinkomplex, oder die durch geometrische Distanzbeziehungen gekennzeichneten Lagebeziehungen von markierten Bereichen in einem aus Proteinen und Nukleinsäuren oder Nukleinsäureabschnitten bestehenden Komplex. Die im Folgenden beschriebene Erfindung erlaubt es, die oben genannten Nachteile des Standes der Technik wesentlich zu verringern. Dabei werden in einer neuen, erfindungsgemäßen Weise verbunden:

  • • Nanolithographische Präparationsverfahren und, die eine Anordnung der zu analysierenden molekularen Strukturen in Rastern („Arrays”) erlauben, die eine auch fernfeldlichtmikroskopische SPDM-Analyse routinemäßig ermöglichen.
  • • Verfahren des PSF-Engineering, soweit dies für höchstauflösende Topologieuntersuchungen (z. B. bei zu messenden Distanzen im Bereich von 20 nm und darunter) erforderlich ist.
  • • Methoden der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM), unter Verwendung von spektralen Kalibrierungsverfahren auf nanolithographischer Basis.

Im Zusammenhang mit geeigneten, erfindungsgemäßen nanolithographisch unterstützten Kalibrierungstechniken werden lichtoptische topologische Vielfach-Messungen an molekularen Strukturen vom Bereich von einem bis wenigen Nanometer bis in den Bereich der konventionellen optischen Auflösung von 100 bis mehrere hundert Nanometer ermöglicht. Bei der bevorzugten fernfeldlichtmikroskopischen Anwendung ist es möglich, mit dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren bis zu mehreren hundert bis mehrere tausend individuelle molekulare Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe oder Multiprotein-Nukleinsäurekomplexe, simultan im Rahmen desselben fernfeldlichtmikroskopischen Gesichtsfeldes zu analysieren und damit eine rasche, topologische Hoch präzisionsanalyse zu ermöglichen, insbesondere auch unter physiologischen Bedingungen (Temperatur, Ionenmilieu, Wirkstoffkonzentration, elektrische und magnetische Felder).

Die Bildung, Umbildung und Disintegration von molekularen Strukturen, wie z. B. Multiproteinkomplexen ist ein entscheidender Prozess ihrer funktionellen Wirkung. Beispielsweise ist bekannt, dass die enzymatische Wirksamkeit eines Proteinkomplexes in entscheidender Weise von seiner Topologie unter physiologischen Bedingungen abhängt. Diese Topologie kann insbesondere auch durch Pharmaka verändert werden. Die erfindungsgemäße Analyse der 3D- bzw. 4D(3D plus Zeit)-Topologie in Abhängigkeit von Wirkstoffeinflüssen gestattet daher einen wesentlichen Beitrag für eine weitere Optimierung der Wirkstoffentwicklung; sie erlaubt es, simultan molekulare Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe unter verschiedenen Bedingungen (z. B. Wirkstoffe) auf hierdurch induzierte topologische Veränderungen getestet werden. Soweit die molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe, in fixierter Form vorliegen, so kann die Analyse der Dynamik der Topologie durch Vergleich der Präparate in verschiedenen funktionellen Phasen erfolgen. Für die langfristige Perspektive eines „High Through Put Screening” besonders vorteilhaft sind dabei fernfeldmikroskopische Verfahren, da diese vollkommen „berührungsfrei” arbeiten und in kurzer Zeit (z. B. einige Minuten oder sogar Sekunden) lichtmikroskopische Informationen von hunderten oder tausenden von molekularen Strukturen registriert und der Datenanalyse zugeführt werden können. In Verbindung mit der erfindungsgemäßen nanolithographischen Kalibrierung, die auch simultan mit der Vermessung der zu analysierenden molekularen Strukturen erfolgen kann, und geeigneter Rechnerkapazität, kann auch eine vergleichbar rasche Analyse der gewonnenen Daten realisiert werden.

Methodische Vorgehensweise

Die erfindungsgemäße Anwendung des SPDM-Verfahrens auf die Topologieanalyse von molekularen Strukturen in Rasteranordnungen auf einen nanolithographisch reaktiven Träger erfolgt in folgender Weise:

I. Ausgangspunkt: Identifizierung von molekularen Strukturen

Das erfindungsgemäße Verfahren soll zunächst am Beispiel der Analyse von biologisch/pharmazeutisch wichtigen molekularen Strukturen dargestellt werden. Methodischer Ausgangspunkt der erfindungsgemäßen Vorgehensweise ist die Identifizierung von funktionell wichtigen molekularen Strukturen, beispielsweise von Multiproteinkomplexen, deren makromolekulare Untereinheiten und gegenseitige Wechselwirkung aufgrund biochemischer/molekularbiologischer Untersuchungen bereits hinreichend gut charakterisiert sind. Als Beispiele seien hier genannt die vielfältigen, hochspezialisierten und funktionell essentiellen, an Membranen (z. B. Zellmembran, Kernhülle, Vesikel) oder fibrilläre Strukturen (z. B. Elemente des Zytoskeletts) gebundenen Multiproteinkomplexe; die Komplexe der Proteindegradationsmaschinerie, die in ihrer Komplexität diejenige der Proteinsynthese erreichen; sowie die aus zahlreichen Untereinheiten bestehenden Komplexe der Replikations-, Transkriptions- und Reparatur-„Maschinerie” des Genoms im Zellkern. Weitere Beispiele sind Verbindungen der oben genannten Multiproteinkomplexe mit Nukleinsäuren oder Nukleinsäureabschnitten. Beispielsweise erfolgen die Replikation, Transkription und Reparatur der DNA, die Bildung von Boten-RNA (m-RNA) aus der transkribierten RNA und deren Transport vom Zellkern zum Zytoplasma, sowie die Proteinsynthese in solchen Multiprotein-Nukleinsäure-Komplexen.

II. Bindung der molekularen Strukturen in einer nanolithographisch hergestellten Rasteranordnung auf einem Reaktiven Träger

Es wird ein nanolithographisch Reaktiver Träger RT mit einer Reaktiven Oberfläche RO verwendet, wie zum Beispiel bei Geyer et al. und Eck et al. beschrieben (Applied Physics Letters, Volume 75, Number 16, 2401, 1999; Advance Materials, Volume 12, 805, 2000).

In einem Bereich des Reaktiven Trägers wird durch ein nanolithographisches Verfahren ein Muster K1 mit Reaktiven Features KF1.1, KF1.2, KF1.3 ... KF1.N., KF2.1, ... KFM.N erzeugt. Im oben genannten Beispiel werden funktionelle Gruppen von selbstaggregierenden Monolagen (SAMs) durch einen Elektronenstrahl kontrolliert modifizieren (Umwandlung von Nitrogruppen in Aminogruppen), so dass definierte reaktive Features für eine molekülspezifische Ankopplung entstehen. Mittels dieses nanolithographischen Verfahrens kann man gezielte und räumlich genau definierte molekulare Modifikation nanostrukturierter Oberflächen herstellen, die die Eigenschaften für einen Träger für das erfindungsgemäße Verfahren gewährleisten. Die Ausdehnung in einer oder mehreren Raumrichtungen muss erheblich kleiner als die durch die optische Auflösung des für die lichtmikroskopische Analyse verwendeten Optischen Systems OS sein. Gekennzeichnet durch die Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) der Punktbildfunktion (Point Spread Function, PSF) verwendeten Optischen Systems in der betreffenden Raumrichtung, und deren Abstand voneinander größer ist als die FWHM des verwendeten Optischen Systems. Es werden nun eine oder mehrere Kalibrierungssubstanz(en) K1, K2 ... mit einer oder mehreren spektralen Signaturen Kspecs 1, Kspecs 2, Kspecs 3 an die Reaktiven Features KF1, KF2, KF3 ... gebunden, wobei der geometrische Abstand zwischen Kspecs 1, Kspecs 2, Kpecs 3 usw. auf den Kalibrierungssubstanzen aus anderen Messungen oder aus den zur Herstellung verwendeten Reaktionsbedingungen bekannt ist. Durch Wiederholung des nanolithographischen Verfahrens in einem Bereich MEAS des Reaktiven Trägers RT ein Muster M1 mit Reaktiven Features MF1.1, MF1.2, ... MF1.L, MF2.1, MF2.2, ... MF.L,K erzeugt wird, wobei der mittlere Durchmesser der Reaktiven Features MF kleiner/gleich dem mittleren geschätzten oder anderweitig bestimmten Durchmesser der zu analysierenden molekularen Strukturen MS ist, und der Abstand der Reaktiven Features MF voneinander sowie von den zur Kalibrierung verwendeten Reaktiven Features KF größer ist als die FWHM des OS in der betreffenden Richtung. Es werden eine oder mehrere zu messende molekulare Struktur(en) MS1, MS2, MS3, ... (Messobjekte) an die Reaktiven Features MF ... gebunden. Die zu messende/n molekularen Struktur/en MS an bestimmten chemisch/biochemisch/molekularbiologisch identifizierten Stellen mit mindestens zwei spektralen Signaturen specs 1, specs 2, specs 3 markiert werden, die bevorzugt mit denen zur Markierung der Kalibrierungssubstanz verwendeten identisch sind. Die Abstände und relativen Lagebeziehungen der durch die spektralen Signaturen identifizierten Positionen auf der/den Kalibrierungssubstanz/en bzw. in den Messobjekten nach Verfahren der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) bestimmt wird, wobei die Kalibrierung der Distanzbestimmung mithilfe der spektral markierten Kalibrierungssubstanzen K1, K2, ... erfolgt.

III. Markierung spezifischer Bereiche von molekularen Strukturen:

Zur lichtmikroskopischen Identifizierung der molekularen Strukturen, wie z. B. von Multi proteinkomplexen und ihrer Untereinheiten, sowie ggf. weiterer Teilregionen, werden spezifische molekulare Markierungsmethoden eingesetzt. Diese Markierungsverfahren müssen abgestimmt sein auf das angewandte Mikroskopieverfahren. Beispielsweise steht für Untersuchungen an fixierten molekularen Strukturen bereits jetzt eine Fülle von Möglichkeiten zur Verfügung, wie die spezifische Bindung von fluoreszierenden Proteinen; insoweit Nukleinsäuren an der betreffenden Multiproteinkomplexe oder ihrer biologischen Funktion beteiligt sind, kann deren Position durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechniken mit Fluorochromen von verschiedener spektraler Signatur (gekennzeichnet beispielsweise durch Unterschiede im Anregungs/Emissionsspektrum bzw. in der Fluoreszenzlebensdauer) markiert werden.

Seit einigen Jahren ergeben sich jedoch darüber hinaus ständig sich erweiternde Möglichkeiten einer In-vivo-Markierung spezifischer Untereinheiten von Multiproteinkomplexen sowie ihrer funktionellen Wechselwirkungspartner. Unter In-vivo-Markierung werden hier Markierungsverfahren verstanden, die eine Analyse der molekularen Strukturen unter physiologischen Bedingungen erlauben, zum Beispiel in einem flüssigen Medium, bei einer auch in lebenden Zellen vorkommenden Konzentration von Wasserstoffionen (pH) und anderen Ionen und Molekülen. Zur Zeit sind hier insbesondere Methoden der Verbindung der zu analysierenden Bereiche mit Konstrukten von Green Fluorescent Proteins” verschiedener spektraler Signatur zu nennen. Andere, gegenwärtig in Entwicklung begriffene Verfahren betreffen die In-vivo-Markierung von spezifischen Proteinen, z. B. mithilfe von einzelsträngigen fluorochromierten oder anders modifizierten Oligonukleotiden. Zusätzlich zu Unterschieden im Anregungs- und Emissionsspektrum sind hier insbesondere spektrale Signaturunterschiede aufgrund der Fluoreszenzlebensdauer von größtem Interesse. Unter spektraler Signatur werden im Folgenden alle physikalischen Eigenschaften verstanden, die eine lichtoptische Identifizierung der Markierung gestatten. Unter Licht wird hier der Bereich elektromagnetischer Strahlung vom Ultravioletten (Vakuumwellenlänge 200 nm) bis zum infraroten (Vakuumwellenlänge 2000 nm) verstanden. Insbesondere werden unter spektraler Signatur Fluoreszenzeigenschaften mit der oben genannten Charakterisierung verstanden. Gegenwärtig kommen für Fluoreszenzmarkierungen 6–10 gleichzeitig einsetzbare, durch die spektrale Signatur diskriminierbare Verfahren in Betracht. Durch konsequente Weiterentwicklung der kürzlich in die Biowissenschaften eingeführten Fluoreszenzmarkierung mithilfe von „Nanokristallen” (Halbleitersystemen von 1–100 nm Durchmesser), sowie der Synthese neuer, photostabiler Fluorochrome mit einem erweiterten Spektrum von Fluoreszenzlebensdauern ist die Möglichkeit einer erheblichen Vermehrung der molekularen Markierungsmöglichkeiten gegeben. Nach dem Stand der Technik ist derzeit eine Erweiterung auf ca. 16 Markierungsmöglichkeiten grundsätzlich durchführbar. Es ist erfindungsgemäß, die Markierung auch vor der Bindung der molekularen Strukturen an den Reaktiven Träger (s. 2.) oder gleichzeitig mit dieser Bindung durchzuführen, oder eine Mischung dieser Verfahren, d. h. einige Markierungen vor der Bindung an den Reaktiven Träger (RT), einige Markierungen während der Bindung an den RT, sowie einige Markierungen nach der erfolgten Bindung der molekularen Strukturen an den RT durchzuführen.

IV. Lichtmikroskopische Analyse der markierten und an den Reaktiven Träger in einer Rasteranordnung gebundenen molekularen Strukturen.

Die lichtoptische Analyse der markierten und an den Reaktiven Träger in einer Rasteranordnung gebundenen molekularen Strukturen erfolgt mit lichtmikroskopischen, bevorzugt fernfeldlichtmikroskopischen Techniken. Neue Fernfeld-lichtmikroskopische Verfahren des „Point-Spread-Function-Engineering” gestatten derzeit experimentell, die optische Auflösung (FWHM) in einer oder mehreren Raumrichtungen auf etwa 100 Nanometer (d. h. um ein Mehrfaches des konventionellen Wertes) zu verbessern. Theoretische Analysen ergaben, dass langfristig im Fernfeld eine optische Auflösung von wenigen zehn Nanometern (entsprechend einem Zwanzigstel oder weniger der eingesetzten Lichtwellenlänge) physikalisch möglich ist, sofern spezifische Wechselwirkungsbedingungen realisiert werden können. Erfindungsgemäß ist der Einsatz aller lichtmikroskopischen, insbesondere fernfeldlichtmikroskopischen Verfahren unter Einschluss von Methoden des PSF-Engineering, die sich in geeigneter Weise mit Verfahren der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) kombinieren lassen.

Bei dem Verfahren der SPDM handelt es sich um eine Methode der digitalen Fluoreszenzmikroskopie, die in Verbindung mit den oben beschriebenen Verfahren der spektral unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierung individueller biologischer Makromoleküle die Analyse der Topologie von molekularen Strukturen weit jenseits der jeweiligen optischen Auflösung (FWHM) des verwendeten Mikroskopiesystems erlauben. Physikalisch beruht dieses Verfahren auf der Positionsanalyse spektral diskriminierter „punktförmiger” Einzelobjekte.

Erfindungsgemäß sind auch solche Strukturen, die nur in einer oder zwei Raumrichtungen eine „punktförmige” Ausdehnung besitzen, d. h. eine Ausdehnung, die wesentlich kleiner ist als die optische Auflösung (FWHM) des zur Analyse verwendeten lichtoptischen Systems in dieser Richtung. Bei der Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Genom-Nanostrukturen (hauptsächlich auch Proteinen und Nukleinsäuren bestehende molekulare Strukturen) in Zellkernen wurde unter Verwendung der konfokalen Laser-Rasterrnikroskopie ein 3D „Auflösungsäquivalent” von ca. 50 Nanometer erreicht; d. h. in einzelnen Zellkernen konnten noch individuelle 3D-Distanzen von 50 Nanometern detektiert werden. Ein Auflösungsäquivalent von 50 nm ist z. B. ausreichend, zur Analyse der Topologie von Genom-Nanostrukturen wesentlich beitragen zu können.

Mithilfe der Verbindung der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie mit weiteren Entwicklungen im Bereich des „Point Spread Function Engineering” und der „Molekularen Kalibrierung” ist es grundsätzlich möglich, bei geeigneter Markierung von Unterbereichen der zu analysierenden Multiproteinkomplexe, z. B. eines Multiproteinkomplexes, ein 3D-Auflösungsäquivalent von wenigen Nanometer zu erreichen:

  • a) Theoretische Analysen der das Auflösungsäquivalent bestimmenden Faktoren haben ergeben, dass unter Verwendung eines geeigneten Fernfeldmikroskopischen Mikroskopiesystems („Point Spread Function Engineering (PSF)” Mikroskopie, z. B. 4Pi, STED, SMI-Mikroskopie), geeigneter Markierung sowie multiplen Messungen in Verbindung mit „Molekularer Kalibrierung”, Auflösungsäquivalente von theoretisch sogar unter einem Nanometer zu erreichen sind („Picometer range”);
  • b) Experimentell wurden kürzlich (1999/2000) an markierten „physikalischen” Testobjekten mit ausreichender Photostabilität der eingesetzten Fluorochrome und in Verbindung mit den genannten neuen Methoden der Mikroskopie Distanzen von 10 bis 60 Nanometer mit einem Fehler (Standardabweichung) von 1–2 Nanometer gemessen. Insgesamt ist damit die grundsätzliche Durchführbarkeit topologischer Analysen von geeignet markierten molekularen Strukturen theoretisch und experimentell gesichert.